梯度洗脱HPLC法测定鸡蛋中替米考星的残留

张莉 郑举 吴昊 刘红云 吴蕾 明文庆 蔡一杰

摘要 [目的]建立雞蛋中替米考星的高效液相色谱残留分析方法。[方法]样品在乙腈提取下经Oasis PRIME HLB固相萃取小柱净化，氮吹浓缩后定容过膜上机检测。采用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以水-磷酸二丁胺缓冲液（97∶25）为流动相A、乙腈为流动相B进行梯度洗脱。检测波长280 nm。[结果]替米考星在0.05～10.00 μg/mL具有良好的线性关系（R2=0.999 8）。替米考星在鸡蛋中的添加水平为0.1、1.0、5.0 μg/mL时，回收率为80.6%～95.7%，批内、批间的相对偏差小于10%。[结论]该试验建立的HPLC法简便、灵敏、准确，适用于鸡蛋中替米考星的测定。

关键词 鸡蛋;替米考星;梯度洗脱HPLC法;残留

中图分类号 S851.34+7文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2019）20-0217-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.20.059

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Determination of Tilmicosin Residues in Egg by Gradient Elution HPLC Method

ZHANG Li1，2，ZHENG Ju3，WU Hao1，2 et al （1.Anhui Province Institute of Veterinary Drug and Feedstuff，Hefei，Anhui 230091;2.Anhui Province Key Laboratory of Livestock and Poultry Product Safety Engineering，Hefei，Anhui 230061;3. Anhui Province Animal Disease Prevention and Control Center，Hefei，Anhui 230091）

Abstract [Objective] The research aimed to establish a method for determination of tilmicosin in eggs by high performance liquid chromatography.[Method]The samples were purified by Oasis PRIME HLB solid phase extraction column under the extraction of acetonitrile.After drying and concentrating，the samples were reused and tested over the membrane.Analysis was performed on a C18 column （4.6 mm×250 mm，5 μm） by gradient elution using water butyl amine phosphate（975∶25）（A） acetonitrile（B）as mobile phase.The determination wave length was 280 nm.[Result]The tilmicosin had a good linear relationship （R2 = 0.9998） at 0.05-10.00 μg/mL. When the addition level of tilmicosin in eggs was 0.1， 1.0， 5.0 μg/mL， the recovery was 80.6% - 95.7%， and the relative deviation within and between batches was less than 10%.[Conclusion]The HPLC method established in this experiment is simple， sensitive and accurate， and is suitable for the determination of tilmicosin in eggs.

Key words Egg;Tilmicosin;Gradient elution HPLC;Residue

鸡蛋是生活中最常见的高营养食材，它含有大量蛋白质和多种微量元素，是人类“理想的营养库”，能滋补身体，也能补中益气，缓解体虚，多数人每天都会吃鸡蛋。我国是一个鸡蛋产量位于世界首位的国家，绝大部分的鸡蛋产自农户和小规模的养殖场，在蛋鸡的饲养过程中，尤其在产蛋期，由于不合理使用药物以及未严格遵守休药期，导致鸡蛋中的药物残留，危害人体健康[1-4]。目前，我国对鸡蛋中药物残留的研究较少，各种标准尚在完善中。笔者针对一种大环内酯类药物——替米考星在鸡蛋中的残留进行方法研究。替米考星是泰乐菌素经水解后的衍生物，是畜禽专用的大环内酯类抗生素，体外抗菌活性强，对支原体、胸膜肺炎放线菌和巴氏杆菌等均有抑制作用，临床上主要用于防治家畜肺炎、禽支原体病及泌乳动物的乳腺炎[5-9]。我国2002年农业部公告第235号及2005年农业部公告第560号规定了替米考星在动物组织中的最大残留限量（MRL）为100 μg/kg，同时在产蛋期时禁止使用替米考星[10-11]。该试验采用梯度洗脱高效液相色谱法，建立鸡蛋中大环内酯类抗生素替米考星的简便、快速、高效的检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料。取新鲜的鸡蛋去壳，充分搅拌，匀质，置2～8 ℃冰箱保存。

1.1.2 药品与试剂 。替米考星对照品（批号K0311407，含量98.9%，中国兽医药品监察所）;乙腈为色谱纯（Merck KGaA 公司）;二丁胺、磷酸、氢氧化钠均为分析纯，国药集团;试验用水为 milli-Q 超纯水。

1.1.3 仪器与设备。Agilent 1100型高效液相色谱仪（G1311A四元泵），G1379A真空在线脱气机，G1315DAD检测器，G1316A柱温箱），美国Agilent公司;BT-125D 电子天平，赛多利斯;IKA涡旋混合机，上海沪西分析仪器厂有限公司;Sigma3-30KS离心机;KQ-500E型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司;HGC-12A氮吹仪，天津市恒奥科技发展有限公司;Oasis PRIME HLB固相萃取小柱（60 mg/3 mL，200 mg/6 mL填料），Waters公司;0.25 μm微孔滤膜，天津津腾试验设备有限公司;10份鸡蛋样品购自市场（合肥市不同超市的品牌）。

1.2 方法

1.2.1 标准储备液的配制。取替米考星对照品适量，精密称定，加乙腈制成每1 mL中含1 mg的溶液，精密量取5 mL，置25 mL容量瓶中，用磷酸溶液（取水900 mL，加磷酸5.71 g，用12.5 mol/L氢氧化钠溶液调节pH至2.5±0. 加水至1 000 mL）稀释至刻度，摇匀，制成0.2 mg/mL的标准储备液。在试验中用磷酸溶液配制成不同浓度的标准工作液，现配现用。

1.2.2 样品前处理。

1.2.2.1 样品的提取。准确称取2.0 g样品于50 mL离心管中，加乙腈10 mL，涡旋混匀，超声10 min，高速冷冻离心8 000 r/min离心10 min。

1.2.2.2 样品的净化。移取5 mL上清液，直接过6cc规格Oasis PRIME HLB固相萃取柱，保持1 s/滴速度，收集滤液。准确量取2 mL滤液至10 mL具塞玻璃管中，在40 ℃水浴氮气吹干。残留样品用磷酸溶液溶解定容至1.00 mL，过0.25 μm滤膜后，转移至2 mL进样小瓶中，待HPLC测定。

1.2.2.3 色谱测定条件。色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流动相：水-磷酸二丁胺缓冲液[取二丁胺16.8 mL，加磷酸溶液（1→10）70 mL，边加边搅拌，放冷后，用磷酸调节pH至2.5±0. 加水至100 mL]（975∶25）为流动相A，乙腈为流动相B，按表1梯度洗脱程序;流速1.0 mL/min;柱温30 ℃;记录280 nm的色谱图;进样量10 μL。

2 结果与分析

2.1 对照品、空白试验、样品的色谱图 替米考星色谱图中包含反式异构体和顺式异构体，相对保留时间为0.9、1.0，色谱图见图1～3。该色谱条件下替米考星的分离度、理论塔板数均符合2015年版中国兽药典的要求，此条件适合测定鸡蛋中的替米考星。

2.2 方法学考察

2.2.1 标准曲线的绘制。精密量取对照品储备液适量，用磷酸溶液稀释成0.05、1.00、2.00、5.00、10.00 μg/mL的系列对照品溶液，按“1.2.2.3”色谱条件，精密量取10 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，测定峰面积，以各对照品质量浓度（X，μg/mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标，进行线性回归计算，得出线性方程为Y=0.369 2X+0.008 4（R2=0.999 8），线性范围为0.05～10.00 μg/mL。结果表明在线性范围内替米考星浓度与峰面积呈现良好的线性关系。

2.2.2 检出限和定量限的测定。吸取适量替米考星标准工作液，用空白鸡蛋样品溶液稀释成0.010、0.025、0.050和1.000 μg/mL，按“1.2.2”样品处理方法处理后，以溶液检测时的信噪比（S/N）分别大于等于3和10作为该药物的检出限和定量限。该方法的检出限、定量限分别为0.025 μg/kg（S/N≥3）、0.050 μg/kg（S/N≥10），符合试验及相关要求。

2.2.3 回收率及精密度测定。采用标准添加法，称取空白鸡蛋样品至50 mL离心管中，添加替米考星标准工作液，制成0.1、1.0、5.0 μg/mL 3个浓度的替米考星空白鸡蛋添加溶液，每种浓度5个样品，重复3批，按“1.2.2”样品处理方法处理后，供HPLC测定，外标法定量，计算回收率、批内、批间变异系数，结果见表2。数据显示该方法回收率和精密度均较好，方法可行。

2.2.4 样品测定。从市场随机购买样品10份，均未检出替米考星药物。

3 结论与讨论

3.1 样品提取及净化方法的优化 替米考星不溶于水，易溶于甲醇、乙腈、丙酮等溶剂。鸡蛋中含有较多的蛋白质，蛋白质会形成泡沫、浑浊或出现沉淀现象时被分析物难以分离。乙腈是一种中等极性的提取溶剂，与大多数兽药的极性较接近，该研究在方法的提取研究过程中，采用酸性乙腈、碱性乙腈、纯乙腈、20%乙腈、50%乙腈、80%乙腈进行提取试验，结果显示，纯乙腈的提取效率最好，对不同浓度的添加试验其回收率均高于80%，符合药物残留检测的要求。在对离心机的转速和时间的选择上，通过试验最终确定8 000 r/min离心10 min的除杂效果最好。

该试验用固相萃取技术进行样品净化。Oasis PRIME HLB固相萃取小柱有别于传统的固相萃取小柱，它不需要活化、平衡、净化时也不需要不同极性或pH的溶剂进行淋洗、洗脱等，该小柱能极大地提高样品分析通道。该试验通过加标回收试验比较了200 mg/6 mL和60 mg/mL 2种规格的固相萃取小柱测定替米考星的回收率，试验结果显示，当用乙腈作为提取溶剂，Oasis PRIME HLB固相萃取小柱（200 mg/6 mL填料）净化时，替米考星的回收率达到80%以上。试验最终选择Oasis PRIME HLB固相萃取小柱（200 mg/6 mL填料）對样品进行净化处理。

3.2 色谱条件的优化 替米考星具有弱碱性和脂溶性，在呈酸性的流动相色谱条件下的反相色谱柱上能较好地保留，试验选择了4款不同品牌的反相色谱柱Phenomenex Luna C18（4.6 mm×200 mm，5 μm）、Waters XSelect CSH C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Aglient Eclipse XDB C18 （4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱和依特利SinoChromODS-AP8（4.6 mm×250 mm，5 μm）进行样品分析，结果表明4种品牌色谱柱均可使替米考星分离度、理论塔板数、对称因子良好。因所分析样品基质复杂，虽然经过提取、离心、净化处理，但是样品在流动相等度洗脱的条件下分析，其分离度和灵敏度均难以满足试验要求，为达到分离度、灵敏度的要求，该试验通过比较流动相A[水-磷酸二丁胺缓冲液（975∶25）]、流动相B（乙腈）不同的梯度洗脱方式，最终确定梯度洗脱：0～30 min，82%～60% A;30～32 min，60%～82% A;32～40 min，82%～18% A，在分析鸡蛋中的替米考星时，其分离度、灵敏度满足鸡蛋中的替米考星残留分析要求。

4 小结

该试验建立的梯度洗脱HPLC法测定鸡蛋中替米考星残留的方法，灵敏度高，专属性强。替米考星的检出限达0.025 μg/kg，采用Oasis PRIME HLB小柱（200 mg/6 mL填料）净化，省去了活化、平衡、淋洗、洗脱等繁琐的操作步骤，处理后杂质干扰少，满足鸡蛋中替米考星残留检测要求。

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