DNA-蛋白质交联的研究进展

黄康敏

摘要 DNA-蛋白质交联（DNA protein crosslinks，DPCs）是一种高毒性的DNA损伤，由紫外线、电离辐射以及甲醛等化合物诱导形成。DPCs会阻碍DNA复制，造成DNA双链缺口，影响基因组的稳定性。目前，研究发现酵母的蛋白酶Wss1和后生动物的蛋白酶SPRTN通过蛋白水解作用参与了DPCs的修复途径，为阐明DPCs的修复机制奠定了基础。对DPCs的影响因素及修复途径进行总结，为DPCs的深入研究提供了一些思路。

关键词 DNA-蛋白质交联;DNA修复;Wss1;SPRTN

中图分类号 R114文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2019）20-0018-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.20.005

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Research Progress of DNA Protein Crosslinks

HUANG Kang min （Guizhou Center for Disease Control and Prevention，Guiyang，Guizhou 550000）

Abstract DNA protein crosslinks（DPCs） are highly toxic DNA lesions，DPCs arise by UV light，ionizing irradiation，are particularly caused by reactive compounds such as formaldehyde.DPCs interfere with DNA replication and transcription，which could result in double strain break （DSB），and affect the stability of genome.It was found that the metalloproteinase Wss1 of yeast and the protease SPRTN of metazoan participated in the DPCs repair through proteolysis，laying a foundation for elucidation of the mechanism of DPCs repair.This review summarized the influencing factors and pathway of DPCs repair，and provided some ideas for further research on DPCs.

Key words DNA protein crosslinks;DNA repair;Wss1;SPRTN

在細胞的生命活动中，各种外源性和内源性因子（如紫外线、活性氧等）会造成DNA损伤，从而导致突变、癌变，甚至死亡[1]。为了维持基因组的稳定性，机体激活DNA损伤应答（DNA damage response，DDR）和DNA损伤耐受机制，处理DNA损伤。DDR具有特异性，能够识别和修复不同的DNA损伤[2-3]。目前已了解多种DDR途径，但DNA-蛋白质交联（DPCs）的具体修复途径尚不明确。

蛋白水解功能参与了DPCs的修复过程[4]，并且后生动物的蛋白酶SPRTN也帮助修复。DPCs是一种特殊类型的DNA损伤，是由拓扑异构酶或者其他蛋白质共价结合DNA形成的交联物。DPCs由紫外线、电离辐射、甲醛等造成，若不及时修复，会阻碍DNA复制和转录，导致基因组的不稳定性，甚至是细胞死亡[5]。 目前，研究发现酵母的蛋白酶Wss1通过DPCs[6]。该研究对DPCs的种类、影响因素以及修复途径进行综述，为DPCs的深入研究提供一些思路。

1 DNA-蛋白质交联的形成

DPCs分为酶型DPCs和非酶型DPCs。酶型DPCs是暂时性结合的酶-DNA复合物受药物等影响后形成的长期性交联的复合物。非酶型DPCs是蛋白质与DNA在内源性或外源性因子的作用下形成的非特异性交联。

1.1 酶型DPCs

细胞正常的生命活动中有大量的酶促反应，某些酶与DNA形成暂时的共价复合物，发挥相应的功能后，能从DNA上解离。然而，酶与DNA结合的共价复合物遇到DNA损伤或者某些药物时，酶不能从DNA上解离，形成了由酶与DNA共价结合的DNA-蛋白质交联，即酶型DPCs[7]。

拓扑异构酶1（Top1）是一种松弛DNA超螺旋的酶。Top1催化DNA双链中的一条链断裂，产生的单链缺口允许DNA链旋转，进而释放DNA的扭转张力。在松弛DNA超螺旋的过程中，Top1共价连接DNA，形成了拓扑异构酶1分离复合物（Top1 cleavage complex，Top1cc）。松弛超螺旋的任务完成后，Top1重新连接单链缺口[8-9]。然而在DNA损伤（如碱基缺失、错配）的作用下，阻碍了单链缺口的重新连接，导致Top1与DNA持续性地共价结合，形成了酶型DPC[10]。除DNA损伤的影响之外，抗癌药物喜树碱（camptothecin，CPT）等能够限制Top1cc，使其成为酶型DPC[11-12]。CPT是Top1的抑制剂，CPT或类似CPT的小分子药物能够插入到Top1与DNA结合的交界，限制Top1cc，阻碍单链缺口的重新连接[11]。单链缺口易转变为双链缺口，会导致遗传信息缺失、基因组重排，甚至是细胞死亡，因此Top1形成的酶型DPC是一种较危险的DNA损伤。

拓扑异构酶2（Top2）不仅能松弛DNA超螺旋，还能促进DNA形成超螺旋。Top2也能与DNA共价结合，形成酶型DPC。抗癌药物依托泊苷（etoposide）是Top2的抑制剂，能够导致Top2与DNA共价交联形成酶型DPC[7]。

研究发现其他的DNA修复酶也形成了酶型DPCs。O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（MGMT）是一种负责从DNA中去除烷基加合物的酶，当细胞被氮芥或致癌物质1，2，3，4-二环氧丁烷处理时，MGMT与DNA共价结合形成DPCs[13-15]。聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶-1 （PARP-1）参与多种DNA修复、DNA损伤检测和染色质重构过程，已被证明在碱基切除修复过程中与DNA共价结合，形成DPC[16]。化疗药物5-AzadC是甲基转移酶抑制剂，能够诱导DNA甲基转移酶（DNMTs）与DNA共价交联[17]。

1.2 非酶型DPCs

不同于酶型DPCs，非酶型DPCs的交联蛋白不具有特异性。根据来源的不同，将诱导DPC的活性分子分为内源性和外源性因子。

1.2.1 内源性因子。细胞代谢过程会产生一些具有活性的副产物，如甲醛、乙醛等活性醛类。这些内源性的活性分子能够诱导蛋白质与DNA发生交联。

甲醛是组蛋白去甲基化过程中的一种中间产物[18]。研究发现甲醛具有遗传毒性和致突变性，可以导致DNA链断裂、DNA-DNA交联以及DPCs[19]。甲醛是交联蛋白质与DNA的有效分子，在染色体免疫沉淀（ChIP）试验中被应用于分离DNA-蛋白质复合物。甲醛所致的DPCs是通过甲醛与氨基酸侧链和DNA碱基的游离氨基或亚胺基团反应形成席夫碱[20-21]。

乙醛是乙醇脱氢酶（ADH）氧化乙醇的代谢产物，乙醛会引起多种DNA损伤，其中包括DPCs。研究发现缺乏乙醛脱氢酶2（ALDH2）会导致乙醛在体内聚积，引起DNA损伤。最终DNA损伤的积累引发了恶性肿瘤，以及细胞的自身降解[22-23]。

1.2.2 外源性因子。

在外界环境中存在多种不同的DPCs诱导剂。DPCs可被离子辐射、紫外线、抗癌药物和重金属（如铬、镍）等诱导形成[24]。许多其他致癌物质也可以诱导DPCs，其中包括烷化剂，如1，3-丁二烯、二环氧丁烷、丙烯醛和巴角醛[25-28]。

离子辐射能产生较高水平的活性氧（reactive oxygen species，ROS），ROS会引发多种类型的DNA损伤，其中包括DNA单链缺口、DNA碱基缺失、DPCs等[29]。DPCs也受紫外线诱导[30]，其机制不完全清楚，可能是紫外线诱导的ROS调控了DPCs的形成[31]。此外，一些抗肿瘤药物（如顺铂及其衍生物、丝裂霉素C等）也会诱导DPCs[32-33]。

多种环境反应的产物也会引起DPCs，如烟草烟雾中存在的二环氧丁烷（DEB）等[34]。此外，活性氮也能引发DPCs，比如一氧化氮（NO）。DNA暴露于NO环境中造成鸟嘌呤脱氮生成新碱基——奥沙宁（Oxanine）。Oxanine能与赖氨酸和精氨酸的氨基反应，有效诱导DPCs[35-36]。

2 DNA-蛋白质交联的修复

DPCs具有一定的危害性，干扰了DNA的相关活动。例如，DPCs阻碍解旋酶对DNA双螺旋的解旋作用，造成DNA复制的停滞，最终阻碍了细胞分裂。DPCs还会引发双链缺口等其他类型的DNA损伤，甚至是细胞死亡。因此，DPCs的修复对于维持基因组的稳定性具有重要作用。

2.1 蛋白酶体参与DPCs的修复

CPT诱导Top1与DNA形成酶型DPCs。研究发现该DPC损伤的修复是通过蛋白酶体的降解途径[37]。首先，修复起始是降解Top1。Top1通过蛋白酶体途径降解后，从DNA上解离。然而DNA上仍保留一些小的肽片段。然后，残余的小肽被酪氨酰-DNA磷酸二酯酶1（Tdp1）催化水解，从DNA上被移去[38]。Tdp1能够催化水解Top1的酪氨酸残基与DNA的3末端之间的化学键[39]。此外，研究发现蛋白酶体能够直接降解DPCs的蛋白质，随后DNA上未完全降解的小肽再通过核酸切除修复切除，使受损的DNA恢复到正常状态[40]。

2.2 蛋白酶Wss1/SPRTN参与DPCs的修复

DPCs的修复可以通过蛋白质水解途径进行。研究发现在芽殖酵母、后生动物等系统中存在DPC特异性的蛋白酶，DPCs的蛋白质被蛋白酶水解为小肽，转变为较小的DPCs，再由其他修复通路进行调控[4，41]。前导链上的DPC阻碍了解旋酶催化DNA双链解旋，DPC的蛋白质被蛋白酶（如Wss1或SPRTN）水解为小肽。然后，跨损伤合成的DNA聚合酶（translesion synthesis polymerase）忽略残余的损伤进行复制，但会导致单碱基突变。DNA复制完成后，核酸切除修复（NER）能够切除残余的DNA损伤[40，42]。

Wss1是酵母中的一种金属蛋白酶，其蛋白酶活性能被DNA活化，作用于与DNA结合的蛋白质，使蛋白质水解[4，43-44]。研究显示酵母细胞在甲醛的作用下，敲除WSS1基因会导致DPCs积累和总染色体重排率上升[4]。蛋白酶Wss1能够作用于由甲醛诱发的非酶型DPC以及CPT引发的酶型DPC，通过水解蛋白质来修复DPCs，促进损伤DNA的正常复制和维持基因组的整合性[4]。在DNA复制过程中，当前进的复制叉受到DPCs的阻碍，复制叉被迫停滞。此时，蛋白酶Wss1结合DNA，水解DPCs的蛋白質，帮助重启DNA复制[4]。因此，Wss1与DPCs的修复密切相关，帮助包含DPCs损伤的DNA顺利完成DNA复制。

Wss1的N端包括了WLM、SHP和VIM基序，C端含有2个SIM基序，研究发现SHP和VIM基序的突变影响Wss1对DPCs的修复[4]。Wss1通过N端的SHP、VIM基序结合分离酶Cdc48的N端形成复合物，Cdc48协助Wss1结合并水解SUMO修饰的蛋白质[44-45]。此外，Wss1通过C端的2个SIM基序结合SUMO分子。苏木化修饰与DNA修复密切相关，如HR修复DNA双链缺口的过程中涉及相关蛋白的苏木化修饰[46]。在DPCs的调控过程中，研究者们推测DPCs的蛋白质可能被苏木化修饰，经SUMO分子标记后被Wss1水解。如经CPT处理后，拓扑异构酶获得了大量苏木化修饰[47-48]。另一观点则认为复制叉受到DPCs的阻碍并停滞后，与复制相关蛋白质被苏木化修饰，进而招募Wss1到损伤位点水解DPCs的蛋白质，移走DPCs[49]。因此，苏木化修饰与DPCs的修复相关，可能是招募Wss1到DPCs损伤位点的关键因素，且Cdc48可能涉及DPCs的修复。

SPRTN是后生动物中与Wss1同源的蛋白酶，其序列与Wss1高度相似[50]。SPRTN与Wss1的功能相似，如SPRTN发挥功能时需要p97（与Cdc48的同源）的协助，能通过C端的基序结合泛素或类泛素小分子[41]。此外两者也存在不同，Wss1能直接结合DNA[4]，而SPRTN是通过PCNA招募到DNA[41]。Wss1在胞内的蛋白浓度低，通过自我分离进行调控，而SPRTN通过泛素—蛋白酶体途径调控表达水平[7]。

蛋白酶SPRTN也参与了DPCs的修复。在哺乳动物细胞中，通过siRNA敲除SPRTN导致细胞对FA高度敏感，以及形成持久性的DPCs[41]。研究发现SPRTN在复制过程中切除DPCs保护增殖的细胞免受DPCs的细胞毒性，然而缺失SPRTN（如RJALS疾病、SPRTN单倍体不足小鼠）引起DPCs的病理性积累，造成DNA复制叉停滞，进而导致DNA双链缺口和基因组的不稳定性[51]。此外，研究发现SPRTN通过一些调节机制提高特异性，防止不涉及DPCs的蛋白质发生错误的水解。如控制SPRTN活性的泛素开关。SPRTN处于单泛素化状态时不能与DNA结合;仅当检测到DPCs时SPRTN才会发生去泛素化，从而使SPRTN能够与受损的DNA位点结合[51]。因此，与DNA结合的SPRTN数量与DPCs的丰度成正比。

2.3 DPCs的其他修复途径

除了上述的修复途径以外，核酸切除修复（nucleotide excision repair，NER）和同源重组修复（homologous recombination，HR）与DPCs的修复和耐受相关，然而这2种经典的修复通路在DPCs修复过程中发挥的具体功能以及调控机制尚不明确。

研究显示缺失NER或HR的酵母细胞对CPT和甲醛都敏感，表明NER和HR与DPCs的耐受相关[4，52]。中国仓鼠卵巢（Chinese hamster ovary，CHO）细胞的NER通路涉及修复FA诱导的DPCs，但并没有涉及修复乙醛诱导的DPCs[53]。此外，研究发现NER只能修复蛋白质较小的DPCs。体外试验显示哺乳动物的NER能够有效去除蛋白质大小在8 kD以下的DPCs，然而在体内不能除去7.4或者8.0 kD的DPCs;研究还发现细菌的NER能够除去交联蛋白小于14 kD的DPCs[54-56]。蛋白质较大的DPCs需通过蛋白裂解成较小的肽，成为能被NER修复的底物。因此，NER可能是蛋白酶Wss1/SPRTN酶切DPCs的下游通路。

研究发现在细菌中，HR参与修复DPCs，且不受蛋白质大小的限制，能够修复蛋白质在14 kD以上DPCs[57]。在哺乳动物中，HR与FA诱导的DPCs的耐受密切相关，包括小于7.4 kD的DPCs[56]。缺失HR的细胞对FA敏感，显示HR涉及修复各种醛类诱导的DPCs[58]。5-AzadC诱导的DNMT形成DPC，造成Rad51焦点和姐妹染色单体交换增加，表明HR涉及修复该损伤[17]。此外，研究表明在大肠杆菌和鸡细胞中，修复DPCs时需要存在DNA双链缺口的形式[59]，而在其他细胞没有观察到该现象[60-61]。Rad52和Wss1在酵母中以非上位的方式参与了甲醛诱导的DPCs的修复，这表明HR和蛋白酶Wss1对DPCs的作用是比较独立的2个途径[4]，这与NER不同。综上，经典的修复通路HR和NER参与了DPCs的修复，且修复途径的选择可能涉及多个因素的影响，如蛋白质的大小、损伤形式和程度等[41]。目前，HR和NER在DPCs修复过程中发挥的具体功能以及调控机制有待更加深入的研究。

3 小结与进展

DPCs是一种特殊类型的DNA损伤，具有一定的细胞毒性，会阻碍DNA复制，导致DNA双链缺口、基因突变、染色体重排，甚至是细胞死亡[5]。根据形成方式不同，DPCs分为酶型和非酶型2种[4]。酶型DPCs是指由酶与DNA共价交联形成。一些酶发挥调控作用时，需与DNA结合形成酶-DNA复合物，如Top1cc。但酶-DNA复合物受碱基缺失、突变等DNA损伤的影响时，导致酶-DNA复合物形成酶型DPCs[7]。另外，一些酶的抑制剂，如Top1的抑制剂CPT[4]、DNA甲基转移酶（DNMTs）的抑制剂5-AzadC等[17]，导致酶与DNA交联形成DPCs。非酶型DPCs是非特异性的蛋白质与DNA共价交联形成。在一些内源性和外源性因子的作用下，会导致非酶型DPCs。内源性因子是细胞代谢过程中产生的副产物，如甲醛、乙醛等活性醛。外源性因子是紫外线、离子辐射、抗癌药物等[5]。

相比DNA单链缺口、碱基缺失等其他类型的DNA损伤，DPCs的具体修复途径并不清楚。研究发现Top1形成的酶型DPCs的修复是通过蛋白酶体和Tdp 蛋白酶體将蛋白质降解，然后残余在DNA上的小肽被Tdp1移走[39]。此外，NER和HR都涉及了DPCs的修复，但具体的作用机制并不清楚。NER作用于蛋白质较小的DPCs，而HR则不受限制[4，52]。最近，研究发现DPCs的修复是通过蛋白质水解途径进行[7]。酵母的蛋白酶Wss 以及后生动物的蛋白酶SPRTN能够水解DPCs的蛋白质为小肽，DPCs转变为较小的复合物，便于DNA能够跨过损伤进行复制[40]。此外，研究发现NER和蛋白酶体或蛋白酶存在协同作用。针对蛋白质较大的DPCs，蛋白酶体和蛋白酶能够先降解或水解蛋白质，使DPCs的大小降低到NER能够修复的范围内，再由NER修复DPCs[40]。而HR和蛋白酶Wss1对DPCs的作用则是相对独立的2个途径[4]。

介绍了DPCs的研究进展，主要总结分析了DPCs的形成以及修复途径，强调了其修复机制的重要性。研究结果提示鉴定参与DPCs修复过程的蛋白质将有助于揭示其具体的修复机制。

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