兔子血液、滑膜、软骨及软骨下骨镉含量检测及相关性分析

马向辉 李明 郭磊

[摘要]目的 研究兔慢性饮水型镉中毒血液、滑膜、软骨及软骨下骨镉含量及其相关性。方法 28只新西兰大白兔，均为两个半月龄，雌雄各半，从雌性及雄性大白兔中各随机取1只，逐次抓取，将其分为对照组及实验组，每组14只，单笼喂养。对照组用正常饮用水喂养，实验组用40 mg/L氯化镉饮用水喂养。3个月后处死，采用原子吸收光谱法测定标本中镉的含量。结果 实验组兔子血液，滑膜、软骨及软骨下骨镉含量较对照组表达明显增高（P<0.05），实验组关节软骨镉含量与软骨下骨、滑膜及血液中的镉含量成正相关（r=0.959，0.556，0.942;P<0.05）。结论 兔慢性饮水型镉中毒可导致镉在血液、滑膜、关节软骨及软骨下骨中蓄积，关节软骨中的镉来源于软骨下骨、滑膜及血液，但主要来源于软骨下骨，镉在上述组织中蓄积，最终可能会导致骨性关节炎发生。

[关键词]镉;中毒;软骨;骨关节炎;兔;膝

[中图分类号] R114          [文献标识码] A          [文章编号] 1674-4721（2019）9（c）-0038-03

[Abstract] Objective To study the content and correlation of cadmium in blood， synovium， cartilage and subchondral bone of rabbits after drinking water with cadmium gradually. Methods Twenty-eight New Zealand white rabbits （equal proportion of male to female） aged two and a half months old， were randomly selected from female and male groups alternatively. They were divided into control group and experimental group， 14 rabbits in each group. They were fed in every single cage. In the control group， rabbits were fed with normal drinking water， and in the experimental group， they were fed with water containing 40 mg/L cadmium chloride. After three months， all rabbits were sacrificed. The cadmium content in the specimens was determined by atomic absorption spectrometry. Results The cadmium content in the blood， synovium， cartilage and subchondral bone of the experimental group was significantly higher than that of the control group （P<0.05）. The cadmium content of the articular cartilage in the experimental group was positively correlated with the cadmium content in the subchondral bone， synovium and blood（r=0.959， 0.556， 0.942; P<0.05）， respectively. Conclusion Chronic poisoning of drinking water containing cadmium can cause cadmium accumulation in blood， synovium， articular cartilage and subchondral bone. Cadmium in articular cartilage is derived from subchondral bone， synovium， and blood， but mainly from subchondral bone. Cadmium accumulates in these tissues and may eventually lead to osteoarthritis.

[Key words] Cadmium; Poisoning; Cartilage; Osteoarthritis; Rabbit; Knee

鎘是一种有毒的重金属，具有很强的生物活性，镉在土壤及水中具有较强的化学活性，进入食物链后，若被人及动物摄入，会在体内蓄积，影响多种脏器功能。研究较多的是镉易在骨及肾脏大量蓄积导致骨质疏松及肾脏的损伤[1]，但镉是否易在关节软骨及滑膜等处蓄积，是否影响其功能，以及如何影响，目前研究较少，本研究通过饮水的方式使兔子染毒，然后测定兔子血液、滑膜、软骨及软骨下骨的镉含量，并对其相关性进行分析，现报道如下。

1材料与方法

1.1实验动物

健康新西兰大白兔28只，山西医科大学实验动物中心提供，均为2个半月龄，平均体重（1.38±0.18）kg，雌雄各半。

1.2实验方法

将28只新西兰大白兔随机分成两组，雌雄各半，每组14只。置于铁笼内，自由摄食及饮水，采用饮水染毒的方法，实验组用40 mg/L氯化镉饮用水喂养，对照组用正常饮用水喂养，其他条件相同。在染毒期间，每日观察并记录每组大白兔的饮水量，饲养3个月后用空气栓塞法处死，开胸后用10 ml注射器从左心室取全血5 ml，放入含抗凝剂的玻璃瓶中-70℃保存。完整剖取双膝关节（包括股骨远端及胫骨近端）全层软骨，剥取双膝关节内滑膜，取胫骨平台处部分软骨下骨，分别放入玻璃瓶中-70℃保存。用15 ml消解液（HNO3与HLO4按4∶1混合）与准确称量质量的标本相混合，完全消化后，用容量瓶定容至50 ml，然后取定容液2 ml，采用原子吸收光谱法测定标本中镉的含量。

1.3统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行数据处理，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验及直线相关分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1两组不同组织镉含量的比较

实验组关节软骨、滑膜、血液及软骨下骨镉含量均明显高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）（表1）。

2.2实验组关节软骨镉含量与滑膜、血液及软骨下骨镉含量相关性分析

关节软骨镉含量与滑膜镉含量成正相关（r=0.556，P=0.039）;与血液镉含量成正相关（r=0.942，P=0.000）;与软骨下骨镉含量成正相关（r=0.959，P=0.000）。其中软骨下骨镉含量相关度最高，血液及滑膜次之。

3讨论

血镉水平可反映兔子体内镉蓄积的程度及近期镉暴露的情况，实验组兔血液中镉含量较对照组明显升高，与其饮用富含镉的水密切相关。镉经消化道吸收后进入兔体内，部分存在于红细胞中与血红蛋白结合，部分存在于血清中，实验组兔滑膜及软骨镉含量均高于对照组，提示其均为镉蓄积的器官，兔滑膜组织中有血液循环，分析镉是通过血液循环进入滑膜的，由于正常关节软骨中没有血液循环，关节软骨中的镉应该来源于与其相邻的有血液循环的软骨下骨和滑膜，软骨下骨中的血液中所含的镉被软骨细胞吸收，滑膜中的镉分泌入关节液后，关节软骨细胞将其吸收可能是关节软骨中镉的来源。

关节滑膜由基质和细胞及纤维构成。内表层平滑，为1～3层结缔组织细胞，又称滑膜细胞，电镜下可见彼此分开而以细棘相连。因功能状态不同可分A及B两种类型。A型滑膜细胞主要清除关节腔和细胞外基质的降解物，B型滑膜细胞合成和调节细胞外基质和滑液的成分。细胞层下方即为毛细血管网，其下为纤维组织，其厚度因部位而不一，含有血管、淋巴管和神经纤维，细胞成分有纤维细胞、巨噬细胞、肥大细胞和脂肪细胞。

关节滑膜可参与关节软骨的破坏过程[2-3]，滑膜发炎时，可以产生多种炎症介质，如白介素-1（IL-1），肿瘤坏死因子（TNF-α）。IL-1可促进滑膜细胞合成并释放前列腺素E2（PGE2）、NO和胶原酶，产生较强的促炎作用，加重滑膜的炎症，能刺激滑膜成纤维细胞增殖，促进滑膜细胞与黏附分子（ICAM-1）的表达，造成关节软骨破坏，而关节软骨破坏产生的颗粒及基质的破坏产物均能诱发和加重滑膜炎，促进IL-1进一步释放。TNF-α可刺激滑膜细胞PGE的产生，增加骨软骨的破坏。IL-1和TNF-α均可导致关节软骨细胞产生降解软骨基质的酶MMP-1、3、13等，从而使关节软骨破坏，导致关节软骨退变发生[4-5]。骨性关节炎又称退行性关节病，骨质增生，骨关节病。以软骨变性为特征性病理改变。李保驰等[6]研究发现，骨性关节炎患者滑膜中的MMP-3及MMP-13表达明显上调。本实验镉在滑膜中蓄积，是否导致滑膜炎发生，尚需对滑膜进行组织学染色观察及对相关因子及酶进行检测以明确。

关节软骨由软骨细胞，软骨基质及水组成。软骨细胞具有合成分泌并维持细胞外基质的功能。细胞外基质由胶原蛋白、蛋白纤维、组织液、非胶原蛋白组成，胶原纤维构成关节软骨的基本框架，维持关节软骨形态结构和抗张力强度的功能。组织液和基质大分子间的相互作用为组织提供硬度和抗机械压力，蛋白多糖带有大量负电荷，可吸附水分子，使软骨具有弹性，抗压性。

软骨下骨指关节软骨沉积线以下的软骨下骨板和骨小梁结构，软骨下骨板位于钙化软骨层与骨小梁之间，为皮质化板层结构，类似于皮质骨。起传导分散应力，抵抗剪切力，紧密联系骨软骨的作用。

软骨与软骨下骨在解剖位置上紧密相邻，生理功能方面密切联系，病理方面相互影响，是一个相互作用、相互依赖、既独立又统一的功能单位。Radin等[7]认为，软骨下骨像一把坚硬的椅子，而关节软骨就像放在上面的软垫，软骨下骨能吸收应力，缓冲震荡，维持关节的正常形状。在负重状态下，关节软骨发生形变，犹如铁轨与枕木之间的橡皮垫，可以保护软骨下骨不受破坏，或者仅发生轻微的损伤。当解除压力，由于弹性作用可迅速恢复原状，这种弹性作用越强，缓冲效果越佳。有研究表明镉可导致骨质疏松[1，8-9]，发生骨质疏松时，软骨下骨脱钙明显，骨量减少，骨小梁数量下降，间距增加，吸收应力能力下降，容易出现微骨折，导致软骨下骨塌陷，正常关节形状发生改变，从而出现关节面受力不均，受力较集中的区域软骨容易发生退行性变。Bobinac等[10]认为，在骨性关节炎中是关节软骨的退行性变导致软骨下骨的生物力学及生化学方面改变，应用组织学及组织化学方法对人工膝关节置换患者及正常尸体膝关节进行研究，结果显示软骨下骨形态学改变发生于关节软骨退变后，且与关节软骨退变程度成正相关。

本研究结果提示，镉可在兔关节软骨及软骨下骨中异常蓄集，可能会导致骨质疏松发生，关节软骨亦可能出现损伤退变，最终导致骨性关节炎发生，但骨质疏松与关节软骨发生的先后及相互影响的机制需进一步研究。

有研究显示[11-12]，镉能引起细胞凋亡。Corcoran等[13]研究结果现示，DNA损伤是引发細胞凋亡的开始。关于镉如何引起DNA损伤，从而导致细胞凋亡，目前有钙通道学说及镉影响如c-jun，c-fos，c-myc等癌基因，抑癌基因p53等学说[14]。而最近有研究显示镉可通过钙通道诱导大鼠肾小管上皮细胞凋亡[15]。

软骨细胞凋亡在骨性关节炎中发挥重要作用。Gibson等[16]在终末分化的软骨细胞培养时发现软骨细胞中存在凋亡现象，裴明等[17]研究结果显示，关节软骨退变时，患者不仅软骨细胞表达A型胶原，而且存在软骨细胞凋亡现象。骨性关节炎患者软骨退变，软骨细胞减少，软骨细胞过度调亡可能是软骨细胞数量减少的重要原因，是发病的重要病理机制，本实验是否导致慢性饮水型镉中毒的兔膝关节软骨细胞出现凋亡目前尚不明确。

本研究结果提示，慢性饮水型镉中毒可导致镉在血液、滑膜、关节软骨及软骨下骨中异常蓄积，推测持续蓄积可能导致骨性关节炎发生。进一步研究滑膜、关节软骨及软骨下骨形态学方面的变化及骨性关节炎相关的因子如IL-1、TNF-α以及金属蛋白酶MMP-3、13等在相关组织中的表达及调控机制能进一步加深对镉在上述组织中蓄积相互间影响的认识。镉可导致多种细胞出现凋亡，但能否导致兔膝关节软骨出现凋亡及作用机制尚不明了，仍需进一步研究。

[参考文献]

[1]吕颖坚.长期环境镉暴露人群骨骼健康效应及骨代谢机制研究[D].广州：南方医科大学，2017.

[2]丁呈彪，周云.膝骨性关节炎患者滑膜炎的发病机制及研究进展[J].中国组织工程研究，2015，19（51）：8327-8332.

[3]Burman A，Haworth O，Bradfield P，et al.The role of leucyte-stromal interactions in chronic inflammatory joint disease[J].Joint Bone Spine，2005，72（1）：10-16.

[4]任志伟.MAPKs通路在兔骨关节炎软骨细胞表达MMP-1/-13中作用的研究[D].上海：复旦大学，2008.

[5]Dankbar B，Pap T.Fibroblastic modulators of bone destruction[J].Z Rheumatol，2016，75（6）：534-536.

[6]李保馳，王维山，董金波，等.MMP-3、MMP-13 在骨性关节炎患者滑膜中的表达及意义[J].中国骨质疏松杂志，2014， 20（6）：593-596，697.

[7]Radin EL，Rose RM.Role of subchondral bone in the initiation and progression of cartilage damage[J].Clin Orthop Relat Res，1986，（213）：34-40.

[8]陈晓.镉致骨毒效应及预后[D].上海：复旦大学，2010.

[9]钱海雷.氟、镉对骨的效应[D].上海：复旦大学，2006.

[10]Bobinac D，Spanjol J，Zoricic S，et al.Changes in articular cartilage and subchondral bone histomorphometry in osteoarthritic knee joints in humans[J].Bone，2003，32（3）：284-290.

[11]Azzonuzi BE，Tsangaris GT，Pellegrini O，et al.Cadmium induces apoptosis in a human T cell line[J].Toxicology，1994，88（1-3）：127-139.

[12]罗通，喻琪旺，刘刚，等.Cd～（2+）致线粒体损伤在rPT细胞凋亡中作用的研究[J].中国兽医科学，2017，47（11）：1468-1474.

[13]Corcoran TP，Fix L，Jones DP，et al.Apoptosis： Molecular control point in toxicity[J].Toxicol Appl Pharmacol，1994， 128（2）：169-181.

[14]余日安.镉与DNA损伤、癌基因表达、细胞凋亡[J].国外医学（卫生学分册），2000，27（6）：359-363.

[15]刘飞.胞内钙重分布在镉所诱导大鼠肾小管上皮细胞凋亡与自噬中的作用[D].济南：山东农业大学，2017.

[16]Gibson G.Apoptosis of terminal differentiated chondrocyte in culture[J].Exp Cell Res，1997，233（2）：372-382.

[17]裴明，曲锦城，于长隆，等.凋亡在骨关节病发病机制中的作用[J].中华骨科杂志，1999，19（3）：167-169.

（收稿日期：2018-05-29  本文编辑：崔建中）