对药酸枣仁-合欢花对抑郁症睡眠障碍模型大鼠行为学及海马5-HT、5-HIAA含量的影响

邓 巍，杜晓娜，施学丽，蔡 涛，薛丽飞，李建橡，郭超峰

（1.开封市第二中医院，河南 开封 475000；2.广西中医药大学，广西 南宁 530200；3.广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 530023）

睡眠障碍是抑郁症最早出现、最常见的症状之一，以入睡困难、多梦、易醒及早醒为特征，可加重抑郁症的病情，延缓其康复进程。严重的抑郁症睡眠障碍（sleep deprivation depresslon，SDD）会导致自杀［1］，因此，寻找有效治疗SDD 的方法十分必要。笔者在总结历代医家治疗抑郁症、失眠经验的基础上，结合长期临床实践发现SDD 的发生、发展与心肝关系密切，认为心肝功能失调是导致抑郁、引发失眠的重要因素，肝气郁结、心神不安是SDD 的重要病机，疏肝解郁、宁心安神是治疗SDD 的基本法则［2］，认为郁寐同治，则寐安郁自解，郁解寐自安。

酸枣仁具有补肝宁心、敛汗生津的功效，实验证实其具有抗抑郁药理活性［3-4］。合欢花有解郁安神、理气和胃功效，研究证明其具有抗抑郁功效［5-6］。二者配伍能疏肝解郁，宁心安神，治疗抑郁性失眠效果良好［2］。因此本实验以慢性不可预见性应激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）结合孤养加快速动眼相（rapid eye movement，REM）睡眠剥夺所致SDD模型大鼠为观察对象，研究对药酸枣仁-合欢花对SDD 模型大鼠学习记忆能力的影响，同时检测海马5-羟色胺（5- hydroxytryptamine，5-HT）、5-羟吲哚乙酸（5-hydroxyindole acetic acid，5-HIAA）含量，并计算两者的比值，初步探讨对药酸枣仁-合欢花抗抑郁的作用机理，为临床治疗SDD提供科学依据。

1 实验材料

1.1 动物 雄性健康清洁级SD 大鼠，体质量180～220g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SCXK（湘）2016-0002。大鼠在室温23～25 ℃、12 h 光照∕12 h 黑暗昼夜交替的环境下，自由饮食，适应环境1周后再进行实验。

1.2 药品与试剂 炒酸枣仁（批号170801921）、合欢花（批号20170101）购自广西中医药大学第一附属医院，经滕建北教授鉴定符合药典要求，并委托广西中医药大学药剂教研室制成浸膏干粉，存在4 ℃冰箱内备用。盐酸文拉法辛缓释胶囊（批号31612026），为北京万生药业有限责任公司产品。5-HT 酶联免疫吸附（ELISA）检测试剂盒（CSB-E08364r）为武汉华美生物工程有限公司产品；5-HIAA ELISA 检测试剂盒（CSB-E13983r）为武汉华美生物工程有限公司产品。

2 方 法

2.1 分组及造模 大鼠适应环境正常喂养1 周后，用旷场实验［7］筛选，去除3 min 内总分数低于30 分或（和）高于120 分的大鼠。选出60 只大鼠，按随机数字表法分为正常组、模型组、西药组、中药组，每组15只。除正常组群养外，其它组孤养，并参照文献［8］，进行21 天的造模。从第19 天开始，采用小平台水环境法［9］，对模型组、西药组、中药组大鼠进行72 h 连续快速动眼相（REM）睡眠剥夺，剥夺箱为玻璃水箱，长30 cm× 宽30 cm× 高40 cm 的圆形水箱，水箱中心有直径为6 cm 的圆形平台，箱中注满水，水面与平台距离约1 cm。大鼠在平台上可自由饮食，如果睡眠，会因肌张力松弛和节律性垂头而掉入水中，从而达到剥夺REM 睡眠的目的，制备成慢性温和不可预知应激（CUMS）结合孤养加REM 睡眠剥夺SDD 大鼠模型。在造模过程中西药组、模型组大鼠各死亡1只，死亡原因不明。

2.2 给药 造模当天开始灌胃给药，西药组予盐酸文拉法辛，剂量为0.008 g∕（kg·d），灌胃容积为10 ml∕kg；中药组予对药酸枣仁-合欢花，剂量为8 g∕（kg·d），灌胃容积为10 ml∕kg；正常组及模型组灌胃给予等容积生理盐水（10 ml∕kg）。每日1次，连续21 d。

2.3 糖水消耗实验 适应性喂养期即开始实验大鼠含糖饮水训练，实验需要4 天，第1 天每笼大鼠同时给2瓶1%的蔗糖溶液，第2天每笼大鼠同时放1瓶1%的蔗糖溶液和1 瓶纯水，第3 天禁饮食，第4 天每笼大鼠同时放1 瓶1%蔗糖水和1 瓶纯水，均先称重。1 h 后，取回2 瓶水，再次称重，计算各组大鼠的糖水偏爱值，糖水偏爱值= 糖水消耗量∕总液体消耗量（即糖水消耗量+纯水消耗量）×100%。

2.4 Morris水迷宫实验 用大小通用Morris水迷宫法对大鼠学习记忆能力进行评估，水池直径160 cm，高55 cm，水深30 cm，平台直径12 cm，高29 cm，没于水下1 cm，使平台不可见。池底黑色，水中加入墨汁，使其呈黑色不透明状。水温24±2 ℃。每天在固定时间测试，操作轻柔，避免不必要的应激刺激，测试结束后都要及时用吹风机吹干大鼠毛发，避免感冒，并且把水池清洗干净。水池上方的枪式摄像机自动记录大鼠的运动轨迹（黑水白物），最后将数据和指标结果导入到Excel，经SPSS软件分析处理得到实验结果。

2.4.1 定位航行试验 从第17 天对受试大鼠进行训练，将受试大鼠分别从4个象限入水点放入水中，记录大鼠在120 s 内到达平台的时间，即为潜伏时间，大鼠到达平台后，使其在平台上停留20 s。如果在120 s内未找到平台，由实验者将其引导至平台并停留20 s，逃避潜伏期记录为120 s。如果在平台上的时间不到20 s，大鼠掉下或跳入水中继续游泳，则将大鼠重新放回平台上，并重新计时，使在平台的时间到达20 s，以确保每只大鼠在每次实验后有相等的时间来观察和获取空间信息。连续训练3 天，于实验第20 天进行正式定位航行试验，取大鼠120 s内从4个象限入水点到达平台所需的平均时间，作为该只大鼠的逃避潜伏期时间。

2.4.2 空间探索试验 第21天撤掉平台，由原平台所在对角象线入水点将大鼠面向池壁放入水中，记录其在120 s内穿过原平台所在位置的次数。

2.5 海马5-HT、5-HIAA 含量的测定 造模第21 天，行为学测试后，将各组大鼠用10%水合氯酸麻醉，腹主动脉取血后，断头处死大鼠，将大鼠头部放置冰台上，迅速分离出海马，冷生理盐水冲去血液，将海马称重，-80 ℃冰箱保存。ELISA 法检测，操作方法依据试剂盒说明书进行。

2.6 统计方法 用SPSS20.0 软件进行统计，实验数据以均数±标准差（±s）表示，用单因素方差进行分析，组间多重比较采用最小显著差法（LSD）检验。P＜0.05为有统计学意义。

3 结 果

3.1 各组大鼠学习记忆能力比较 见表1。

表1 各组大鼠学习记忆能力比较 （±s）

表1 各组大鼠学习记忆能力比较 （±s）

注：与正常组比较，①P＜0.05，②P＜0.01；与模型组比较，③P ＜0.05，④P ＜0.01

组 别正常组模型组西药组中药组n 15 14 14 15剂量（g∕kg）－ －0.008 8逃避潜伏期时间（s）31.8±2.53 54.2±2.15①44.5±2.36③42.3±3.84③穿越平台次数（次）5.8±1.3 2.3±1.5②4.4±1.4④4.5±1.6④

由表1可知，与正常组比较，模型组大鼠逃避潜伏期时间增多（P＜0.05），穿越平台次数减少（P＜0.01）；与模型组比较，西药组、中药组大鼠逃避潜伏期时间缩短（P＜0.05），进入平台次数增加（P＜0.01）。

3.2 各组大鼠糖水偏爱值的比较 见表2。

表2 各组大鼠糖水偏爱值的比较 （±s）

表2 各组大鼠糖水偏爱值的比较 （±s）

注：与正常组比较，①P＜0.05；与模型组比较，②P＜0.05

组 别正常组模型组西药组中药组n 15 14 14 15剂量（g∕kg）－ －0.008 8造模前79.3±2.11 76.4±2.14 77.9±3.20 79.1±2.37造模第21天77.5±2.16 48.6±2.18①68.7±3.22②69.3±2.64②

由表2可知，造模前，各组大鼠糖水偏爱值没有明显差异（P＞0.05）。造模第21 天，与正常组比较，模型组大鼠糖水偏爱值明显降低（P＜0.05）；与模型组大鼠比较，中药组、西药组大鼠糖水偏爱值均明显升高（P＜0.05）。

3.3 各组大鼠海马5-HT、5-HIAA含量的比较 见表3。

表3 各组大鼠海马5-HT、5-HIAA含量比较 （±s）

表3 各组大鼠海马5-HT、5-HIAA含量比较 （±s）

注：与正常组比较，①P＜0.05；与模型组比较，②P＜0.05

组 别正常组模型组西药组中药组n 15 14 14 15剂量（g∕kg）－ －0.008 8 5-HT（ng∕ml）484.54±29.43 331.46±20.89①391.53±19.31②441.67±27.84②5-HIAA（ng ∕ml）15.56±0.64 11.56±0.91①12.93±0.80②12.14±0.77②5-HIAA∕5-HT 比值0.032±0.004 0.029±0.003①0.031±0.002②0.031±0.003②

由表3可知，与正常组大鼠比较，模型组大鼠海马5-HT 及5-HIAA 含量减少（P＜0.05），5-HIAA ∕5-HT比值下降（P＜0.05）；与模型组大鼠比较，中药组、西药组大鼠海马5-HT 及5-HIAA 含量增加（P＜0.05），5-HIAA ∕5-HT比值升高（P＜0.05）。

4 讨 论

随着社会的进步和竞争的日益激烈，SDD 的发生率越来越高，临床工作者对SDD 的治疗愈来愈重视。睡眠障碍（主要是失眠）是抑郁症的核心症状之一，是抑郁症发生、复发的前兆症状或重要危险因素，其严重程度与抑郁症严重程度一致，临床上99%的抑郁症患者伴有睡眠障碍［10］。因此睡眠障碍的有效防治对于预防抑郁症、减轻病情、缩短病程及改善结局有非常重要的意义。中医学因具有天人合一的整体观念，擅长身心整体调理，在防治抑郁症、失眠方面卓显特色和优势，因此加强对防治SDD 有效方药作用机制的研究，将对抑郁症的防治具有重要的现实意义。

抑郁症的发生机制尚不清楚。应激性生活事件是心境障碍的明显促发因素［11］，本实验采用目前国内外公认的CUMS 结合孤养加REM 睡眠剥夺方法建立SDD 大鼠模型，用糖水消耗实验评估造模前后大鼠对糖水偏爱的程度，验证模型是否复制成功及药物干预是否有效。结果表明，与正常组比较，模型组大鼠糖水偏爱值降低，说明SDD 模型大鼠对获得奖赏的快感反应下降，与SDD 患者的核心症状（快感缺失）非常相似，说明SDD 大鼠模型复制成功。经对药酸枣仁-合欢花治疗21 d 后，中药组大鼠糖水偏爱值增加，说明其具有治疗SDD的功效。

临床上SDD 患者常存在认知方面的改变，如学习记忆障碍、思维缓慢、反应迟钝等。Morris 水迷宫是研究和评价动物空间学习记忆能力的应用最广泛的行为实验［12］。本实验研究结果表明，与正常组大鼠比较，模型组大鼠在Morris 水迷宫实验中逃避潜伏期时间增加（P＜0.05），在Morris 水迷宫实验中穿越平台的次数减少（P＜0.01）；与模型组比较，西药组、中药组逃避潜伏期时间缩短（P＜0.05），穿越平台次数增多（P＜0.01）。提示对药酸枣仁-合欢花可以提高SDD 大鼠的学习记忆能力。

抑郁症的发病机制至今尚未明确，存在多种假说，但单胺类神经递质假说是至今研究最早也最深入的假说。“单胺假说”认为抑郁症发生的生物学基础主要与脑内单胺递质5-HT 和（或）NE 的缺乏密切相关。5-HT 是脑内极为重要的神经递质，它不仅参与对焦虑、抑郁情绪的调节，还参与睡眠的生理调节过程［13］，被称为是脑内的“致眠因子”［14］。海马5-HT 含量或功能异常可引发精神病、睡眠障碍等疾病，并与学习、记忆、行为和情绪密切相关。5- HIAA 是5-HT 的代谢终产物，脑内5-HIAA 和5-HT 的比值能间接反应5-HT 的活跃程度［15-16］。本实验采取ELISA 测定大鼠海马5-HT、5-HIAA 含量，并计算两者之间的比值来探讨对药酸枣仁-合欢花治疗SDD 的作用机制。结果表明，经过21天的造模后，与正常组比较，模型组大鼠海马5-HT、5-HIAA 含量及其比值均下降（P＜0.05）；与模型组比较，西药组、中药组5-HT、5-HIAA 含量及其比值均升高（P＜0.05）。

本研究证明，对药酸枣仁-合欢花可减缓SDD 模型大鼠的抑郁行为，具有抗抑郁作用，并能提高其学习记忆能力，其机制可能与提高海马部位5-HIAA、5-HT 含量及其比值有关，具体作用机制需进一步深入研究，如检测外周血液中5-HT、5-HIAA 含量，并分别与中枢5-HT、5-HIAA 进行关联分析，以确定对药酸枣仁-合欢花能够改善SDD 的症状是否与同时调控中枢与外周5-HT、5-HIAA含量有关。