清开灵对小胶质细胞缺氧活化诱导的脑微血管内皮细胞Toll样受体4、gp91phox和闭锁小带蛋白-1表达的影响

田超，玛娜璐璐，袁梦晨，王丽琴，安娜，张涵莱，邢雁伟，孙逸坤，高永红

1.北京中医药大学东直门医院中医内科学教育部和北京市重点实验室，北京市 100700；2.中国中医科学院广安门医院，北京市100053

全世界每年脑卒中发病人数约1500万，是导致残疾和死亡的主要原因，其中缺血性脑卒中超过85%[1-2]。缺血性脑卒中是一个复杂的病理生理过程，与细胞凋亡、细胞毒性、炎症、活性氮和活性氧引起的氧化损伤有密切关联，这些病理变化会引起血脑屏障破坏，损害神经功能[3-5]。

小胶质细胞是神经系统特有的免疫细胞，与神经系统多种疾病相关，在缺血性脑卒中的病变过程中也发挥重要作用[6]。脑缺血后，小胶质细胞活化，既分泌神经营养因子保护神经元，也分泌促炎因子包括活性氧，导致氧化应激性损伤[7-9]。活性氧等促炎细胞因子引发一系列炎症级联反应，引起脑微血管内皮细胞损伤和紧密连接破坏，导致血脑屏障功能和结构受损[10-11]。

清开灵注射液具有清热解毒、化痰通络和醒神开窍的作用，是以安宫牛黄丸为基础研发而来。清开灵注射液临床对缺血性脑卒中有明确疗效，能促进神经功能恢复，改善患者预后[12-14]。本研究观察清开灵注射液能否通过抑制小胶质细胞的活化，提高脑微血管内皮细胞的存活和功能。

1 材料与方法

1.1 材料

清开灵注射液(国药准字Z11020269，10 ml/支)：亚宝北中大(北京)制药有限公司。小鼠Balb/c 脑微血管内皮细胞：中日友好医院娄晋宁教授惠赠。小鼠BV2 小胶质细胞(No.3111C0001CCC000063)：中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心。DMEM高糖培养基：GIBCO 公司。ECM 培养基：SCIENCELL 公司。优质胎牛血清：PAA 公司。青链霉素混合液：北京索莱宝科技有限公司。米诺环素：SIGMA公司。一氧化氮检测试剂盒：北京普利莱基因技术有限公司。Cell Counting Kit-8(CCK-8)细胞增殖-毒性检测试剂盒：上海东仁化学科技有限公司。Toll 样受体4 (Toll-like receptor 4,TLR4)、gp91phox一 抗：SANTA公司。闭锁小带蛋白-1 (zonula occludens-1,ZO-1)：INVITROGEN公司。鼠抗β-actin、过氧化物酶标记羊抗兔IgG：武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

小鼠BV2细胞培养在胎牛血清和青链霉素混合液配制的DMEM 培养基中，37 ℃、5% CO2、饱和湿度培养箱中培养。生长至90%以上细胞汇合时，加0.05%胰酶消化液消化传代。

小鼠Balb/c 细胞培养在配好的ECM 完全培养基中，37 ℃、5% CO2、饱和湿度培养箱中培养。生长至90%以上细胞汇合时，加0.25%胰酶消化液消化传代。

将生长良好的BV2 细胞悬液以1×105/ml 接种于24孔培养板中。生长至80%细胞汇合时，PBS溶液洗2 次，更换无血清DMEM 培养基缺氧培养。细胞分为6 组：正常组单用无血清DMEM 培养基培养；模型组用无血清DMEM 培养基，置1.0%O2、37 ℃三气培养箱中缺氧培养24 h，再置于37 ℃、5% CO2培养箱中复氧培养24 h；清开灵0.0625%组在无血清DMEM 培养基中加入0.0625%清开灵注射液，缺氧培养24 h 后复氧；清开灵0.125%组在无血清DMEM 培养基中加入0.125%清开灵注射液，缺氧培养24 h 后复氧；清开灵0.25%组在无血清DMEM 培养基中加入0.25%清开灵注射液，缺氧培养24 h 后复氧；米诺环素组在无血清DMEM 培养基中加入200 nmol/L 米诺环素，缺氧培养24 h 后复氧，复氧时更换无血清DMEM 培养基。复氧24 h后，小心吸出上清备用。

Balb/c 细胞正常培养48 h，生长至80%细胞汇合时，吸除96 孔培养板中的培养基，PBS 溶液清洗2次，每孔加入各组小胶质细胞上清100 μl，37 ℃、5%CO2培养箱中静置24 h，倒置相差显微镜观察细胞生长情况。

1.2.2 CCK-8检测

Balb/c 细 胞 每 孔加 入CCK-8 检测 液10 μl，孵育40 min。波长450 nm 下检测各孔上清液吸光度值(A值)。

1.2.3 一氧化氮浓度

Balb/c 细胞每孔吸取培养上清液50 μl，波长540 nm 下检测各孔上清液吸光值，根据标准曲线计算样品浓度。

1.2.4 Western blotting

BV2 细胞接种在6-well Insert 膜上层，正常培养48 h 至80%细胞汇合。PBS 溶液洗2 次，分组同前，膜内外加入相应药物，正常组置37 ℃、5% CO2培养箱中培养，其他各组置1.0% O2、37 ℃三气培养箱中缺氧培养。

6 孔板中接种Balb/c 细胞，正常培养48 h 至80%细胞汇合。小心吸除培养基，分别将缺氧培养24 h 的BV2 细胞移入六孔板中，Insert 内外加DMEM，置37 ℃、5%CO2培养箱中复氧培养24 h。

提取Balb/c 细胞总蛋白，BCA 定量后，等体积加入5×buffer，100 ℃煮沸20 min 备用。蛋白样本电泳，电转，5%脱脂奶粉摇床上室温封闭1 h，加入配好TLR4 (1∶1000)、gp91phox(1∶1000)、ZO-1 (1∶1000)和β-actin(1∶3000)一抗，4 ℃过夜。TBST 溶液洗膜3次，加入二抗，室温孵育1 h，TBST 洗3 次。暗室内膜上滴加发光液，避光压片、显影、定影、晾干待用。扫描胶片，使用Image J 计算灰度值，计算目的蛋白与内参蛋白β-actin的比值。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 内皮细胞活性

倒置相差显微镜下观察，正常组内皮细胞约60%～80%贴壁良好，紧密连接成片，细胞体为铺路石样。缺氧后，细胞由贴壁变为悬浮，胞体逐渐变圆，与正常组有明显区别(图1)。

CCK-8 检测模型组A 值低于正常组(P＜0.05)；清开灵0.0625%、0.125%和0.25%组及米诺环素组A 值均较模型组升高(P＜0.05)。见表1。

2.2 一氧化氮浓度

模型组一氧化氮浓度较正常组增加(P＜0.05)。清开灵0.0625%和0.125%组一氧化氮浓度较模型组下降(P＜0.05)。见表1。

表1 各组脑微血管内皮细胞活性和一氧化氮浓度比较

2.3 Western blotting

模型组TLR4 蛋白表达较正常组增加(P＜0.05)。清开灵0.25% 组TLR4 蛋白表达较模型组下降(P＜0.05)。

模型组gp91phox蛋白表达较正常组增加(P＜0.05)。清开灵0.0625%、0.125%和0.25%组及米诺环素组gp91phox蛋白表达较模型组降低(P＜0.05)。

模型组ZO-1 蛋白表达较正常组降低(P＜0.05)。清开灵0.0625%、0.125%和0.25%组及米诺环素组ZO-1蛋白表达提高(P＜0.05)。见图2、表2。

图1 各组脑微血管内皮细胞形态(倒置相差显微镜，×100)

图2 各组内皮细胞Western blotting结果

3 讨论

缺血性脑卒中后炎症反应导致血脑屏障破坏，贯穿整个病程，引起脑水肿、神经细胞死亡，发病后抑制炎症反应，可保护和修复血脑屏障[15-16]。脑微血管内皮细胞是血脑屏障重要组成部分，细胞间以紧密连接方式相连，形成基本骨架结构，保证血脑屏障的结构完整和功能正常[17]。小胶质细胞活化后分泌大量促炎因子，激活TLR4、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)氧化酶等相关蛋白和通路，产生大量活性氧，破坏内皮细胞间紧密连接蛋白结构，造成血脑屏障结构和功能丧失，损害神经系统功能[18-20]。细胞体外培养实验能避免混杂因素干扰，在观察单因素对细胞模型的影响时尤为适用。我们选用小鼠小胶质细胞BV2细胞体外培养，模拟缺血再灌注损伤模型，利用清开灵注射液进行干预；然后将BV2 细胞和Balb/c 细胞共培养，观察清开灵通过抑制小胶质细胞活化，保护血脑屏障内皮细胞的作用及其机制。

表2 各组内皮细胞TLR4、gp91phox和ZO-1蛋白表达(/β-actin)

本研究显示，清开灵注射液能够有效保护内皮细胞活性，进而保护血脑屏障的结构和功能。一氧化氮是一种重要的气体效应分子和信号分子，可作为第二信使在诸多疾病的病理生理过程中发挥作用[21]。缺血时，一氧化氮能生成毒性更强的OH-和NO2-，引发酪氨酸硝基化反应，加重脂质过氧化程度，破坏紧密连接等蛋白，损伤内皮细胞和神经元细胞[22-23]。本研究显示，0.0625%和0.125%浓度清开灵注射液可减少内皮细胞一氧化氮生成，保护内皮细胞。

TLR4 作为细胞因子白细胞介素1β (interleukin-1β,IL-1β)的上游受体TLRs 家族的重要成员，广泛表达于中枢神经系统各细胞，包括小胶质细胞和血管内皮细胞，在缺血性脑卒中后激活，可引发一系列炎症反应，包括激活NADPH 氧化酶产生活性氧，从而介导血脑屏障破坏[24-28]。本研究显示，0.25%清开灵注射液能显著降低内皮细胞TLR4 蛋白表达，从而减低炎症反应，保护内皮细胞。

gp91phox是NADPH 氧化酶的主要功能亚基，gp91phox蛋白表达可以反映NADPH 氧化酶的激活情况[29-31］。本研究显示，清开灵注射液可降低内皮细胞gp91phox蛋白表达，降低NADPH 氧化酶激活，减少活性氧产生，保护血脑屏障。

ZO-1作为胞质辅助蛋白的主要构成物质，是紧密连接复合体重要的组成部分，能够连接内皮细胞，保持血脑屏障的结构和功能[32-33］。TLR4信号通路及其下游蛋白可导致紧密连接结构功能障碍，破坏血脑屏障[28］。本研究显示，清开灵注射液可抑制内皮细胞ZO-1蛋白的破坏，促进紧密连接形成，保护血脑屏障功能。

综上所述，本研究采用缺氧诱导BV2小胶质细胞活化，刺激Balb/c 内皮细胞损伤，通过对细胞活性、一氧化氮含量及TLR4、gp91phox和ZO-1 等相关蛋白的表达检测，发现清开灵注射液可能通过抑制小胶质细胞缺氧活化，降低脑微血管内皮细胞TLR4 和gp91phox蛋白表达，提高ZO-1 蛋白表达，提高脑微血管内皮细胞的存活和功能，从而减轻小胶质细胞缺氧活化对脑微血管内皮细胞的损伤。