髓样分化蛋白-2研究进展

王芷涵　罗艺晨　帅学宏　顾国婧　李博文　李文杰　周志雄　赵宇　伍莉　陈吉轩　黄庆洲　焦寒伟

摘要    髓样分化蛋白-2（Myeloid differentiation protein-2，MD-2）是一种分子量为20～30 kD的分泌蛋白，它结合在Toll样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）胞外区，能与TLR4组成复合体（MD-2/TLR4），在细菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）的识别及其信号转导中发挥重要作用，MD-2也是目前炎症、感染、免疫等病理过程研究的热点之一。本文对MD-2基因结构、基因表达及MD-2与机体天然免疫等方面研究结果进行综述，以期阐释MD-2的基因与天然免疫的关系，为揭示MD-2基因的功能提供技术参考。

关键词    MD-2;TLR4;信号转导;天然免疫

中图分类号    Q71         文献标识码    A

文章编号   1007-5739（2019）19-0210-03                                                                                     开放科学（资源服务）标识码（OSID）

Research  Progress  on  Myeloid  Differentiation  Protein-2

WANG Zhi-han    LUO Yi-chen    SHUAI Xue-hong    GU Guo-jing    LI Bo-wen    LI Wen-jie    ZHOU Zhi-xiong    ZHAO Yu    WU Li    CHEN Ji-xuan    HUANG Qing-zhou    JIAO Han-wei *

（College of Animal Sciences，Veterinary Scientific Engineering Research Center，Southwestern University，Chongqing 402460）

Abstract    Myeloid differentiation protein-2 is a kind of molecular weight of 20-30 kd secreted protein，it combines the toll-like receptor 4（TLR4）extracellular area，and forms a complex with TLR4（MD-2/TLR4）.In the recognition and signal transduction of LPS，it plays an important role，too.Futhermore，MD-2 is one of the hottest spot of research such as the inflammation，infection，and immune pathological process.This paper summarized the structure，gene expression of MD-2 and innate immune reaction to MD-2，in order to elucidate the relationship between MD-2 gene and natural immunity and provide technical references for revealing the function of MD-2 gene.

Key words    MD-2;TLR4;signal transduction;innate immune

MD-2是一種分子量为20～30 kD的分泌蛋白[1]，它结合在TLR4胞外区，能与TLR4组成复合体（MD-2/TLR4）引起TLR4的活化，在LPS的识别及其信号转导中发挥重要作用。此外，MD-2还是天然免疫中的调控分子，在炎症、感染、免疫等病理过程中发挥极为广泛的生物学功能。MD-2的功能研究对治疗脓毒症和肝脏相关疾病具有重要意义[2-4]。对MD-2水平的调控有可能成为治疗脓毒血症的有效方法[5]。本文对MD-2基因等方面研究结果进行综述，以期阐释MD-2的基因与天然免疫的关系，为揭示MD-2基因功能提供参考。

1    MD-2基因概述

1.1    MD-2结构

MD-2蛋白由160个氨基酸组成，分子质量为25～30 ku，因其与MD-1具有高度同源性而被鉴定和命名，其N端有1段由16个氨基酸残基组成的信号肽，使MD-2具有分泌性[5-6]（图1）。

MD-2由二硫键连接成稳定的二聚体或寡聚体、多聚体，属于ML蛋白家族，含ML-功能结构域，与LPS信号转导和脂质代谢有关，它在结构上可能存在2个相对独立的功能结构域，使其能与LPS直接结合，并促进LPS和TLR4结合。其中单体MD-2比多聚体MD-2更易于结合TLR4，能更有效地赋予TLR4对LPS的反应性。同时研究表明，MD-2氨基酸序列上的2个糖基化位点（26位和114位）和7个半膀氨酸残基（25、37、51、95、105、133、148位）对MD-2的功能发挥具有重要作用，MD-2的第102～116位富含碱性芳香族氨基酸，可形成一环形，能中和LPS，结合LPS和脂磷壁酸（lipoteichoic acid，LTA），抑制细菌生长[7-8]。

1.2    MD-2基因表达

髓样分化蛋白-2是近年新发现的参与机体识别细菌脂多糖的重要基因，MD-2基因多态性与创伤后多器官功能衰竭、脓毒症的发生和预后有着密切联系[9]。

大量研究猜测，MD-2基因启动子区-1625G可能是一个重要的导致严重创伤后并发症发生的危险区域。MD-2基因启动子-1625C/G单核苷酸多态性与汉族人严重创伤后多器官功能衰竭、脓毒症的易感性相关，-1625G可能是严重創伤后并发症发生的危险因素。同时化学发光结果显示，-1625C→G碱基变异可增强MD-2基因启动子活性，变异引起的MD-2基因启动子活性的增强最终有可能导致靶基因表达升高，从而影响TLR4、MD-2、CD14复合物对LPS的反应性[9-10]。

2003年有学者在对创伤患者进行观察后发现，患者体内TLR4、MD-2基因表达均降低，预后良好的在伤后第5天恢复正常水平，预后差的则仍处于低水平。创伤可引起内毒素血症，创伤后人外周血单核细胞内TLR4、MD-2 mRNA的表达与患者的免疫机能、预后情况密切相关。因此，推测TLR4、MD-2表达的降低可能是机体对过度炎症反应而产生的一种保护性措施[11]。

大量研究发现，正常雌性和雄性大鼠肺组织均可表达少量TLR4、MD-2和肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF-α）基因，性别间差异均无显著性，但脓毒症雌性大鼠各项指标表达均明显弱于雄性。LPS注射后大鼠心肌组织、大鼠肝脏组织TLR4、MD-2及TNF-α基因表达均存在性别差异，内源性雌激素的作用可能导致雌性脓毒症大鼠心肌组织对LPS的反应性弱于雄性，肝脏组织损伤较雄性轻。目前认为脓毒症发生的根本原因在于机体过度释放细胞因子和炎性介质导致炎症反应失控和免疫机能紊乱。内源性雌激素可能通过抑制TLR4/MD-2基因表达而减弱脓毒症发生时细胞信号转导通路的活化，从而介导了对雌性脓毒症大鼠肝脏功能的保护作用[12-14]。

研究表明，脓毒症可迅速上调心肌组织TLR4、MD-2基因广泛表达，脓毒症发生时TLR4识别LPS是以TLR4/MD-2复合体形式完成的，而且在识别过程中MD-2是TLR4必需的作用分子[15]。在此状态下大鼠心肌TLR4/MD-2基因表达变化规律基本保持一致，同时TLR4、MD-2基因表达上调又能促进LPS刺激局部组织合成、释放早期炎症细胞因子——TNF-α，从而可能共同参与了机体失控性炎症反应的病理生理过程[16]。

此外，MD-2基因启动子区域的rs11465996多态性与新生儿坏死性小肠结肠炎（Necrotizing enterocolitis of newbo-rn，NEC）严重程度有关[17]。

CHI Xinjin等[18]研究表明，MD-2基因降低使TLR2/4活化作用的增加减弱，降低了原位自体肝移植后的急性肺损伤。目前国内已成功构建人TLR4及MD-2基因反义真核表达载体，为研究其在肺炎症反应中的作用奠定基础[19]。

2    MD-2与机体天然免疫

2.1    与TLR4组成复合体

近年来，荧光共振能量转移（fluorescence resonance ene-rgy transfer，FRET）技术为TLR4和MD-2在活体细胞中的相互作用提供了直接证据。TLR4的功能需要有髓样分化蛋白-2的辅助，在只有TLR4而没有MD-2存在的情况下，细胞对LPS不发生反应或反应微弱[6];另一方面，TLR4 mRNA与MD-2 mRNA表达具有显著正相关[15]，这表明它们在机体免疫方面具有一定联系。

TLR4识别LPS信号是以TLR4/MD-2复合受体的形式完成的，而且在识别过程中MD-2是TLR4必需的作用分子[16]，其表达的功能域结合TLRs并在TLRs激活中发挥关键调控作用[18]，起调节TLR4的胞内分布和辅助TLR4识别LPS作用;另一部分MD-2释放到血浆中，形成可溶性MD-2（sMD-2），在白细胞分化抗原14（CD14）参与下能结合血浆中的LPS[5]。

MD-2、TLR4以及白细胞分化抗原14（CD14）三者通常组成复合物受体识别LPS，完成信号传导。复合物结构的完整性是其发挥功能的基础，其中，MD-2与TLR4结合，赋予TLR4对各种配体（包括LPS）的反应性，并且与TLR4在细胞内的分布密切相关[2，8，20]。因此，MD-2不仅仅是TLR4的辅助分子，而且还是天然免疫中的调控分子，可能在感染、炎症、免疫等病理生理过程中具有更广泛的生理学功能[8]。

可溶性TLR4/MD-2受体复合物能显著降低细菌感染后炎症性细胞因子IL6 /IL8的分泌水平以及炎症细胞表面共刺激分子的表达，它能有效阻断体外感染模型中炎症介质的释放，为探索新的炎症性损伤防治途径提供了试验依据[3]。

一系列研究显示，LPS可以对心肌组织TLR4/MD-2进行上调基因表达，本过程中，MD-2是TLR4必需的作用分子。TLR4和MD-2结合在细胞表面形成的受体复合物在LPS诱导的免疫应答中具有关键作用。这个变化有可能是引发术后全身炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）的分子机制之一[7]。

2.2    相关药物

近年来，越来越多髓样分化蛋白-2的相关药物和物质受到重视。研究发现，苦参素对EAE大鼠有防治作用，其作用机制可能与下调大鼠脊髓中TLR4和血清中MD-2的表达有关，其通过影响TLR4/MD-2的表达进而影响EAE的发病情况[1]。槐定碱作用于TLR4/MD-2，以抑制TLR4-NF-κB-TNF-α通路活化来作为其抗内毒素机制之一[21]。

宣白承气汤能减轻内毒素致ALI大鼠肺组织损伤，对肺损伤有保护作用，其机制可能与其能降低内毒素致ALI大鼠MD-2 mRNA、髓样分化蛋白抗原（myeloid differential pro-tein-88，MyD88）蛋白及其mRNA的表达有关[22];此外，ZHA-NG Yali 等[23]研发出了新的姜黄素类似物MACs，它通过与LPS竞争结合到MD-2上，进而抑制TLR4/MD-2信号复合物，其中MAC17和28具有最强的抗炎作用，90%以上抑制了LPS刺激巨噬细胞的细胞因子分泌，对LPS诱导的急性肺损伤和脓毒症有防卫作用。

分化诱导剂豆蔻酸-佛波醇-乙酯酸（PMA）在浓度1～100 ng/mL下均可将THP-1细胞诱导分化为成熟巨噬细胞，增加诱导质量浓度可显著提高炎症因子TNF-α、IL-6的分泌水平，但对其膜表面受体MD-2表达和分布无明显影响。因此，对内毒素致炎效应的研究，应尽可能选择低质量浓度的PMA（1.5 ng/mL），因为低质量浓度的PMA既可诱导THP-1分化为形态和活性良好的成熟巨噬细胞，又可避免过高的炎症因子TNF-α、IL-6的分泌，从而可最大程度地减小诱导过程对于后续的巨噬细胞功能试验的影响[24]。

2011年，丙泊酚已经广泛应用于ICU脓毒症、严重创伤等危重患者的镇静治疗，早期使用丙泊酚对脓毒症大鼠肝脏具有明显的保护作用。研究显示，正常大鼠肝组织内可见少量TLR4、MD-2 mRNA表达，脂多糖可迅速上调肝组织中TLR4、MD-2基因的广泛表达，丙泊酚干预后TLR4、MD-2 mRNA表达明显下降，对脓毒症大鼠有明显的治疗作用。肝组织中TLR4、MD-2基因的表达与早期脓毒症的发生、发展密切相关，2种基因的mRNA表达成显著正相关，动态监测TLR4、MD-2 mRNA改变对脓毒症发病及治疗过程具有一定意义[25]。

Wolf-Grosse等[26]试验表明，氧化铁纳米颗粒（iron oxide nanoparticles，IONPs）对TLR配体诱导的细胞因子有不同程度的影响，颗粒介导的TLR4诱导细胞因子的增强不能用补体激活来解释，而是依赖于TLR4/MD-2和CD14。在Saenger等[27]的研究中，牛奶蛋白αS1-casein被确认为是TLR4星质域的粘结剂，相较于LPS而言，αS1-casein对于TLR4/MD2显示出更高的亲和力。

2.3    临床应用

视网膜缺血再灌注（ischemia reperfusion，I/R）损伤在许多眼科疾病中很常见。Huaicheng Chen等[28]的研究表明，TL-R4参与缺血性视网膜损伤，抑制MD-2可能是调节TLR4信号通路和缺血性视网膜损伤中有害下游效应的一种新途径。MD-2参与TLR4-NADPH氧化酶4（NADPH oxidase4，NOX4）复合物的形成，在视网膜I/R损伤的发病机制中发挥关键作用。因此，抑制MD-2可减少视网膜I/R损伤过程中TLR依赖性损伤。

高迁移率组box-1（High mobility group box-1，HMGb1）是一种内源性危险因子相关分子模式蛋白（danger-associated molecular pattern protein，DAMP），其胞外释放与无菌损伤以及各种炎症疾病和条件有关，现已被证明是一种有价值的临床药物靶点。根据研究发现，假设二硫化物A-box片段与TLR4/MD-2结合，而不促进TLR4二聚体的形成，则其可与HMGb1结合位点竞争，从而达到防止HMGb1诱导信号转导和下游炎症的目的。促炎B-box片段保留MD-2活性构象，并与复合物中的TLR4蛋白结合，协助TLR4二聚体的形成，激活细胞内信号通路下游炎症通路和细胞因子释放[29]。

Babazada等[30]研究表明，自组装脂肪肝素衍生物通过拮抗TLR4/MD-2来抑制免疫系统，其对乙二醇拆分肝素-d-红细胞-鞘氨嘧啶偶联物（glycol split heparin-d-erythrosp-hin-gosine conjugates，NAHNP）及其具有短脂链的区域选择性脱硫衍生物与TLR4/MD-2相互作用的生物物理性质进行了研究。二维核奥弗豪斯效应光谱研究表明，在乙二醇裂解后，肝素主干获得了额外的适应性，有助于与蛋白质结合。然而，与天然肝素或乙二醇拆分非抗凝剂肝素（nonanticoag-ulant heparin，NAH）不同，NAH的疏水衍生物迫使硫酸酸化的艾杜糖醛酸残基的构型从2S0斜船型改变为1C4椅型，而肝素和NAH则并未有明显效果。NAHNP则显著地抑制脂多糖诱导NF-κB转录因子的激活，当它与TLR4/MD-2结合时，亲和力为62.3 nM。基于生物传感器的结构动力学关系研究表明，6-O-sulfo组d-氨基葡萄糖残基在与受体复合物的TLR4和MD-2结构域精氨酸结合中起重要作用，6-O-sulfo基团的脱硫使缔合动力學下降，导致亲和力降低800 nM。与脂多糖类似，NAHNP的2个脂族链与MD-2口袋结合，链长度下降导致NF-κB转录抑制活动以及与TLR4/MD-2的结合亲和力的丧失。

色氨酸tRNA合成酶（Tryptophanyl-tRNA synthetase，WRS）是一种具有非典型功能的氨基酰基tRNA合成酶（am-inoacyl-tRNA synthetases，ARSs）。在细菌感染过程中释放全长WRS，启动TLR4/MD-2复合物，诱导先天免疫应答。有研究表明，重组WRS蛋白处理细胞可以促进炎症细胞因子和1型干扰素（type 1 interferons，IFNs）的产生，并抑制THP-1和Raw264.7细胞中的病毒复制，但在TLR4-/-或MD-2-/-骨髓源性巨噬细胞（bone marrow-derived macrophages，BMD-Ms）中则不能[31]。

在疫苗的设计和配制方面，一种名为佐剂的疫苗成分可增强宿主免疫系统对抗原的识别，从而刺激其细胞和适应性反应。特别是具有自组装特性的合成toll样受体激动剂被认为是佐剂开发的良好候选者。TLR4衍生20残基肽（TR-433）存在于TLR/MD-2复合体的二聚反应界面，在短暂转染TLR4/CD14/MD-2和Balb/cmice的THP-1单核细胞和HEK293T细胞中诱导促炎反应，作为一种新的佐剂在治疗应用中具有很大的发展潜力[32]。

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