壮族与汉族颈动脉粥样硬化患者的血清同型半胱氨酸水平及亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性▲

卢红华 许亮掌 覃发凤

(广西南宁市邕宁区人民医院，1 内科，2 内儿科，3 呼吸内科，南宁市 530299，电子邮箱：lhh891@126.com)

脑血管疾病严重威胁着中老年人的身心健康，随着人口老龄化的加剧，脑血管疾病的危害也日益加重[1]。其中缺血性脑卒中是导致中老年人残疾甚至死亡的首要原因[2-3]。颈动脉粥样硬化(carotid atherosclerosis，CAS)的发生以及其斑块的形成，是老年人发生缺血性脑卒中、短暂性脑缺血等缺血性脑病的重要危险因素，其受多种因素影响，如吸烟、饮酒、高血压、高血脂、高同型半胱氨酸血症等[4-5]。已有大规模流行病学研究证实，血清同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)水平升高是缺血性脑血管事件发生的独立危险因素，其与血管危险性事件的发生风险之间呈剂量依赖关系[6]。亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolate reductase,MTHFR)是Hcy的代谢酶，C677T点突变是其常见的基因突变类型，可使该酶活性下降，导致血浆Hcy的水平明显升高。另有研究指出，血浆Hcy水平和MTHFR C667T基因多态性能增加早期缺血性脑卒中的发生风险[7]，且MTHFR C667T基因多态性与民族有关[8]。但血浆Hcy水平及MTHFR C677T基因多态性是否与不同民族的CAS的发生发展有关，目前仍缺乏相关研究报道。壮族是我国人口最多的少数民族，而广西则是壮族人口最多的省份，其壮族总人口达1 444.85万人[9]。本研究选择在我院就诊的汉族及壮族CAS患者作为研究对象，分析两者Hcy水平、MTHFR C667T基因多态性的差异，旨在为颈动脉硬化粥样硬化的防治提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2017年1月至2019年1月我院内科收治的89例CAS患者为研究对象。纳入标准：(1)直系家属报告或自我报告其三代以内均为壮族血缘(或汉族血缘)；(2)年龄20～75岁。排除标准：(1)既往有心、肝、肾功能不全及精神异常者；(2)既往患糖尿病、脑梗死、出血性脑血管疾病者；(3)既往有血液系统疾病、恶性肿瘤、自身免疫病者；(4)3个月内服用过影响Hcy水平的药物者；(5)病历资料不完整者。其中壮族47例，汉族42例。壮族组和汉族组一般资料比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)，具有可比性。见表1。

表1 两组一般资料的比较

注：▲曾经吸过100支烟和每月至少饮酒1次。

1.2 观察指标的检测方法

1.2.1 血清Hcy含量的测定：抽取所有研究对象清晨空腹静脉血3 mL，采血后不抗凝，于1 h内以4 000 r/min离心10 min分离血清，由本院检验科采用日立HLTACHI-7600全自动生化分析仪测定血清Hcy水平。

1.2.2 MTHFR C677T基因多态性检测：(1)标本采集。抽取所有研究对象清晨空腹静脉血3 mL，抗凝后充分摇匀，4 000 r/min离心10 min。(2)DNA提取。取中层白细胞，使用Solarbio公司的全血基因组DNA提取试剂盒(批号：D1850-50)提取基因组DNA。(3)目的基因扩增。上游引物为5′-TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA-3′，下游引物为5′-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3′，引物由上海生物工程技术有限公司合成。按照PCR检测试剂盒(南京诺维赞生物科技有限公司，批号：P102-d1)配制PCR反应体系20 μL，包括ddH2O 6.6 μL，2×Phanta Max Buffer 10 μL，dNTP Mix 0.4 μL，上下游混合引物1.6 μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 0.4 μL，DNA模板1 μL。PCR条件为预变性94℃ 5 min，解链94℃ 30 s，退火62℃ 30 s，延伸72℃ 30 s；循环35次后再以72℃延伸7 min。扩增完成后向PCR产物加入2 μL 10×loading buffer混匀备用。(4)PCR产物检测。取2 μL的PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳，将凝胶板放在紫外透射仪的石英玻璃上检查PCR扩增产物。(5)使用限制性内切酶Hinf Ⅰ在37℃水浴下消化扩增产物；配制20 μL反应体系，将ddH2O 7.5 μL，PCR扩增产物10 μL，10×缓冲液(美国NEB公司)2 μL，Hinf Ⅰ限制性内切酶(美国NEB公司)0.5 μL加入到200 μL离心管，将离心管置于37℃温浴至少8 h。温浴后将酶切产物加入3%琼脂糖凝胶孔中，接通电源并设置电压110 V后电泳约90 min，电泳后用凝胶成像系统(美国BIO-RAD，版本号：Gel Doc XRt)在紫外灯下观察酶切后电泳带及其位置，以DNA Marker(198 bp)为标准对照，将电泳结果数据保存分析。

1.3 CAS判断 所有入组患者均使用日本日立HI VISION Avius L型四维彩色多普勒超声仪进行检查。患者平卧，暴露颈部，将中心频率7.5 MHz的探头置于颈部，分别检查左右颈总动脉(约为颈总动脉分叉前1 cm处)、颈总动脉分叉处、颈内动脉(约为颈总动脉分叉后1 cm处)等3个位置血管后壁的内-中膜厚度(intima-media thickness,IMT)；IMT值表示血管内膜面至中层外表面的厚度；局部放大所测量部位，调节声束方向，与管壁垂直后方可测量；取6个部位的IMT平均值作为最终结果。根据颈动脉IMT值来判断患者是否存在CAS，IMT≤1.0 mm为正常，1.0 mm

1.4 统计学分析 采用SPSS 22.0软件进行统计分析。计量资料以(x±s)表示，组间比较采用t检验；计数资料以例数或百分比表示，组间比较采用χ2检验。采用拟合χ2检验对各组的基因型进行Hardy-Weinberg平衡检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 MTHFR基因C677T位点基因型的Hardy-Weinberg平衡检验 47例壮族组患者中检出CC基因型6例，CT基因型28例，TT基因型13例，T等位基因频率为57.45%，C等位基因频率为42.55%；在42例汉族组患者中检出CC基因型15例，CT基因型21例，TT基因型6例，T等位基因频率为39.29%，C等位基因频率为60.71%。Hardy-Weinberg平衡检验结果显示两组观察值与理论值之间差异无统计学意义(均P>0.05)，表明本研究人群MTHFR C677T基因型频率分布符合Hardy-Weinberg平衡，研究对象是同一群体。见表2。

表2 MTHFR基因C677T位点基因型的Hardy-Weinberg平衡检验

2.2 两组MTHFR C677T基因多态性的比较 壮族组MTHFR C677T基因T等位基因频率及TT基因型频率均高于汉族组(均P<0.05)。见表3。

表3 壮族与汉族患者MTHFR C677T基因多态性的比较[n(%)]

2.3 两组血清Hcy水平的比较 壮族组血清Hcy水平为(26.41±6.82)mol/L，高于汉族组的(23.34±8.21)mol/L，但是两组差异无统计学意义(t=1.625,P=0.089)。

3 讨 论

Hcy是一种含硫氨基酸，体内的Hcy是饮食摄取的蛋氨酸经代谢后产生的中间代谢产物。血清Hcy水平上升会影响血管平滑肌细胞、损伤血管内皮细胞，激活炎症介质和活化炎症反应，介导氧化应激反应，并可影响体内转甲基化反应，从而导致机体发生CAS病变，进而造成血管受损，最终出现心脑血管事件[10-12]。有研究表明MTHFR基因多态性与血清Hcy水平有关[13]，但不同的研究报道结果仍存在较大差异[14]。

有学者发现MTHFR基因多态性与地域、民族等因素有关[8，15]。本研究结果显示，壮族患者的TT基因型及T等位基因频率均高于汉族(均P<0.05)，但两者血清Hcy水平差异无统计意义(P>0.05)，提示动脉粥样硬化患者中壮族与汉族人群MTHFR基因多态性存在差异，但MTHFR基因多态性的差异或许并不影响汉族与壮族人群的血清Hcy水平，这可能与血清Hcy代谢途径有关。血清Hcy主要的代谢途径有3种：在辅酶维生素B6催化下转化为半胱氨酸，被甜菜碱甲基化成蛋氨酸，在辅酶维生素B12催化下被甲基四氢叶酸甲基化生成蛋氨酸。叶酸是甲基化途径的甲基间接供体，也是维生素B6、维生素B12催化Hcy代谢的关键辅酶，而MTHFR是甲基直接供体甲基四氢叶酸的关键酶，可见，维生素B6、维生素B12、甜菜碱、叶酸摄入不足，或MTHFR发生基因突变使甲基四氢叶酸合成不足等因素均可导致Hcy代谢出现异常，而MTHFR基因多态性只是影响血清Hcy水平众多因素中的一种[16]。

本研究中，虽然两组Hcy水平差异无统计学意义，但壮族组血清Hcy水平稍高于汉族，这可能与壮族人群高钠饮食、喜食糯米与糯米制品、腌制食品、不健康的生活方式，教育程度低有关，但仍需进一步研究证实。目前仍没有足够的证据证实CAS患者的血清Hcy水平与民族存在的较高相关性，可能是由于本研究纳入的样本数较少，对研究结果产生一定的偏倚。

综上所述，CAS患者中，壮族与汉族人群的MTHFR C667T基因多态性存在差异，但Hcy水平差异无统计学意义，其或不受代谢酶基因多态性的影响。