耐铅菌与生物炭、有机肥配施对铅污染土壤的修复效果

郜雅静，李建华，靳东升，卢晋晶，籍晟煜，张云龙，郜春花

（1.山西大学生物工程学院，山西太原030006；2.山西省农业科学院农业环境与资源研究所，山西太原030031）

铅作为农业环境中主要的重金属污染元素之一，主要随着大量矿山的挖掘，工业废气、废水、废渣的乱排，农业肥料的喷施，日常垃圾的堆弃等途径，沉积到农田土壤中，且很难被降解，最终随着土壤—植物—动物逐级累积，最终进入人体，对人类的健康和生存构成威胁[1]。我国是一个典型的生产与消耗铅的大国，每年铅矿开采量高达90 万t，其中，超过40万t 被消耗[2]。2010 年李国平[3]调查发现，我国粮食含Pb 量大于1.0 mg/kg 的产地有11 个。铅是土壤中很常见并且分布十分广泛、含量也较高的重金属元素[4]，它可以通过改变土壤微生物活性，影响土壤生态平衡，导致土壤功能失调、土质恶化等一系列环境问题。

目前，重金属污染土壤修复已经开展了许多工作，就修复技术比较，生物修复具有费用低、效果好等优势，具有良好的发展前景[5-6]。由于某些微生物对污染土壤中的重金属具有氧化还原、吸附、沉淀的作用，它们可以通过降低重金属的毒性，改善植物根际环境，增加土壤肥力，促进植株的生长。但是直接施加微生物可能会导致微生物流失或被吞噬，对重金属的固定能力有限，而且微生物生长的代谢能力不佳。一些研究将微生物吸附于载体上，再加入污染土壤中，发现载体可以为微生物生长提供营养源和保护区域，有利于微生物较快适应新环境[7]。所以本研究运用生物强化技术，将耐铅菌联合生物炭、有机肥来修复铅污染土壤，以提高修复效率。

山西省农业科学院农业环境与资源研究所农业微生物课题组前期从太原市重金属污染土壤中筛选出耐铅菌（GDYX03），通过16S rDNA 序列分析鉴定为肠杆菌属（Enterobacter），利用透射电镜和红外光谱分析该菌可知，其主要依靠细胞表面吸附Pb2+。确定了该菌株在铅污染水体中吸附的最佳条件是菌龄72 h，pH 值5～6，接菌量5 g/L，温度30 ℃，时间30 min，初始Pb2+浓度100 mg/L，在此最佳条件下吸附率达98.85%，吸附量达19.73 mg/g[8]。生物炭具有孔隙大、表面活性大、吸附能力强等优势，被广泛应用于重金属的修复。另外，它还具有性质极稳定的碳结构，能够增加有机质含量、增强土壤肥力[9]、改良土壤性质、增加作物产量[10]。有机肥能够为微生物提供所需的养分，提高微生物在土壤中的代谢能力。同时，有机肥的加入，还可以提高土壤肥力、促进土壤养分的转换，疏松土壤、改善土壤微环境。

本试验将耐铅菌分别联合生物炭、有机肥对铅污染土壤的修复效果进行研究，以期为重金属铅污染修复提供一定的技术支撑。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株 其由山西省农业科学院农业环境与资源研究所农业微生物课题组从太原市污染土壤中分离筛选，经鉴定为肠杆菌属（Enterobacter ludwigii）GDYX03。该菌株形态呈扩展形，表面光滑凸起，易挑起，乳白色且半透明，为革兰氏阴性菌。

1.1.2 供试载体 市售的生物炭、商品有机肥，其基础性质分别列于表1，2。

表1 生物炭理化性质

表2 有机肥的养分含量

1.1.3 供试作物 青美油菜（Brassica napus L.），购于山西瑞丰种业。

1.1.4 供试污染土壤制备 添加一定浓度的外源铅溶液，加入去离子水，使土壤水分达到田间持水量的70%，充分混匀装入塑料框中，干湿交替，老化10 个月，获得一定铅浓度的试验土壤[11]，具体性质列于表3。

表3 土壤基础性质

1.2 试验设计

试验设置12 个处理（表4）。所用土壤过2 mm筛，载体与土壤混匀后装盆，每盆2 kg 土，同时加入基肥20 g（N∶P2O5∶K2O＝4∶3∶3）从育苗盘挑选长势均匀的3 株移入，以称重法保持土壤含水量在田间持水量的75%左右。4 个菌梯度分4 次加入，生长时间55 d。生物炭和有机肥用量参考王婷[7]试验的用量。

1.3 样品采集

1.3.1 植株样品的采集 收获时，用小铲子将植株完整地从盆中轻轻挖出，分离地上、地下部，先用自来水冲洗干净泥土，再用去离子水冲洗干净，105 ℃杀青30 min，然后65 ℃烘干，粉碎，装入自封袋中储存，用于测定植株铅含量。

表4 耐铅菌与生物炭、有机肥配施的试验处理 g/kg

1.3.2 土壤样品的采集 挖起植株，采用抖落法收集根区土壤，用灭过菌的镊子去除土壤中的杂质，其中，一部分装入已编号的无菌自封袋，置于4 ℃冰箱，尽快进行微生物活性分析；一部分风干、磨碎、过筛，用于土壤中铅含量的测定和土壤酶活性的分析。

1.4 测定项目及方法

1.4.1 植株铅含量 加入硝酸，高氯酸酸化，使用微波消解仪消解，采用火焰原子吸收分光光度计（240FSAA）测定植株铅含量（mg/kg）[12]。

1.4.1.1 土壤有效态铅含量 用DTPA（二乙三胺五乙酸）浸提剂（0.005 mol/L DTPA＋0.1 mol/L TEA（三乙醇胺）＋0.01 mol/LCaCl2） 浸提，0.45 μm 微孔滤膜过滤， 采用火焰原子吸收分光光度计（240FSAA）测定土壤有效铅含量（mg/kg）[13]。

1.4.1.2 土壤总铅含量 加入盐酸- 硝酸- 氢氟酸- 高氯酸酸化，微波消解仪消解，采用火焰原子吸收分光光度计（240FSAA）测定土壤总铅含量（mg/kg）[13]。

1.4.2 土壤酶活性 脲酶活性采用苯酚钠- 次氯酸钠比色法测定；磷酸酶活性采用磷酸苯二钠法测定；蔗糖酶活性采用3，5- 二硝基水杨酸比色法[14]测定。过氧化氢酶活性采用紫外分光光度法[15]测定。

1.4.3 土壤微生物数量 其采用稀释平板计数法测定，其中，细菌培养使用牛肉膏蛋白胨培养基，放线菌培养使用改良高氏Ⅰ号培养基，真菌培养使用孟加拉红培养基[16]。

1.5 数据统计

盆栽试验数据用4 个重复的平均数±标准偏差表示；差异显著性用SPSS 18.0 软件进行Duncan法检验（P＜0.05 表示差异达显著水平）。采用Microsoft Excel 2007 软件作图。

式中，C地上为油菜地上部铅含量（mg/kg）；C地下为油菜地下部铅含量（mg/kg）；C土壤为土壤残留铅含量（mg/kg）。

2 结果与分析

2.1 耐铅菌与不同吸附载体配施对油菜生物量的影响

表5 耐铅菌与不同吸附载体配施对油菜生物量的影响

从表5 可以看出，与CK 相比，其他处理油菜地上部、地下部生物量都增加，地上部鲜质量显著增加，地下部鲜质量（除J 处理外）、地上部干质量和地下部干质量除J、T 处理外，其余处理均显著增加。F、J 配施处理的4 种生物量都大于T、J 配施处理，主要是由于加入的有机肥为铅污染土壤带来丰富的有机质，改善了土壤性质，提高了土壤肥力，促进了植物生长[17]。随着接菌量的增加，油菜地上部鲜质量、地下部鲜质量、地上部干质量、地下部干质量4 种生物量都表现为先增大后减小。在生物炭、有机肥2 种载体与不同接菌量配施处理后，生物量分别在T＋J2、F＋J2 处理达到最大值，T＋J2 处理4 种生物量较CK 分别增加27.16%，40.59%，15.81%，35.71%；F＋J2 处理4 种生物量较CK 分别增加34.06%，84.12%，18.70%，77.86%。

2.2 耐铅菌与不同吸附载体配施对油菜铅含量的影响

2.2.1 耐铅菌与不同吸附载体配施对油菜地上部铅含量的影响 从图1 可以看出，与CK 相比，各处理油菜地上部铅含量均出现显著降低，降幅达到11.96%～56.78%。CK、J、T、F 处理油菜地上部铅含量由大到小分别为CK＞J＞F＞T。与CK 相比，T、J配施处理和F、J 配施处理的油菜地上部铅含量降幅分别为49.33%～56.78%，20.78%～30.40%，T、J配施处理降幅较大。在生物炭、有机肥分别与4 个菌梯度配施处理中，随着接菌量的增加，油菜地上部铅含量先减少后增加，其中，T＋J2、F＋J2 处理油菜地上部铅含量最低，分别为17.72，30.01 mg/kg。

2.2.2 耐铅菌与不同吸附载体配施对油菜地下部铅含量的影响 由图2 可知，耐铅菌与吸附载体不同配施对油菜地下部铅含量的影响与地上部铅含量变化一致，与CK 相比，其他处理油菜地下部铅含量也均显著降低，且T、J 配施处理降低得较多。T、J 配施处理和F、J 配施处理油菜地下部铅含量分别为309.90～329.32，334.95～370.08 mg/kg。其中，T＋J2、F＋J2 处理油菜地下部铅含量最低，分别为309.90，334.95 mg/kg， 分别较CK 降低22.94%，16.71%。

与CK 相比，不同处理均能显著降低油菜地上部、地下部铅含量。这可能是因为植物对金属的吸收量主要取决于土壤有效态重金属浓度。耐铅菌与生物炭、有机肥配施后可调节土壤微生态环境，促进养分活化，增加植物生物量；同时达到降低土壤有效态铅含量的效果，减少了植物对铅的吸附作用。董同喜等[18]研究发现，畜禽粪便可降低水稻土中重金属的生物有效性，进而降低水稻的重金属铅含量；曹书苗等[19]通过研究也发现，加入生物肥可降低黑麦草土壤有效态铅含量，导致黑麦草地上和根部铅含量降低。这与本研究结果相似。

2.3 耐铅菌与不同吸附载体配施对油菜中铅转移因子、富集系数的影响

由表6 可知，与CK 相比，其他处理油菜中铅转移因子和富集系数都降低。T、J 配施处理转移因子、地上部富集系数、地下部富集系数、总富集系数较CK 分别降低37.23%～49.32%，24.15%～30.96%，50.27%～58.60%，25.84%～33.64%。F、J 配施处理转移因子、地上部富集系数、地下部富集系数、总富集系数较CK 分别降低13.31%～21.75%，9.50%～20.54%，25.36%～36.68%，11.13%～22.03%。其中，T＋J2、F＋J2 处理地上部富集系数、地下部富集系数、总富集系数均最小，T＋J2 处理的3 种富集系数分别较CK 降低30.96%，58.60%，33.64%，F＋J2 处理的3 种富集系数分别较CK 降低20.54%，36.68%，33.64%。

铅主要积累于植株根系中，地下部分对铅的富集能力远高于地上部分，导致地下部分铅含量高于地上部分。说明铅不易在植株体内转运，由转运因子也可以看出，加入吸附载体后增加了油菜生物量，降低了油菜地上部、地下部铅含量，这有利于控制植株体内的铅残留[20]。石汝杰等[21]研究发现，铅更易于被黑麦草地下部吸收，不同处理地下部累积铅含量均大于地上部，这与本试验研究结果一致。植株受铅胁迫生长后，随着土壤中铅含量增加，油菜地上部和地下部的铅含量也增加，土壤中铅含量与植株内部铅含量有一定的相关性。曹书苗[17]在研究黑麦草对铅的耐受性和积累时也得出相似的结果。

表6 耐铅菌与不同吸附载体配施对油菜中铅转移因子、富集系数的影响

2.4 耐铅菌与不同吸附载体配施对土壤铅含量的影响

2.4.1 耐铅菌与不同吸附载体配施对土壤有效态铅含量的影响 重金属有效态可反映重金属移动性、毒性和生物有效性，其受土壤重金属总量、有机质含量等多种因素影响[22]。从图3 可以看出，与CK相比，其他处理土壤有效态铅含量均出现显著降低，降幅达9.67%～21.76%。在生物炭、有机肥分别与4 个菌梯度配施处理中，T＋J2、F＋J2 处理土壤有效态铅含量最低，较CK 分别降低21.76%，12.61%。加入生物炭对降低土壤有效态铅含量效果较大，可能是因为生物炭有很大的比表面积，且带负电荷，能与重金属阳离子发生静电吸附作用，吸附土壤中大量的重金属离子，从而减少重金属在土壤中的转化[23]。CAO 等[24]研究发现，在200 ℃下制备的牛粪生物炭对土壤中Pb2+的吸附量最大达到680 mmol/kg。LU 等[25]研究表明，生物炭吸附土壤铅离子的主要途径是铅离子与生物炭的含氧官能团发生表面吸附以及在矿物质表面生成络合物。

2.4.2 耐铅菌与不同吸附载体配施对土壤残留铅含量的影响 从图4 可以看出，与CK 相比，其他处理土壤残留铅含量均增加，增幅达到2.47%～11.78%。在生物炭、有机肥分别与4 个菌梯度配施处理中，T＋J2、F＋J2 处理残留铅含量最大，分别为949.70，891.33 mg/kg， 分别较CK 增加11.78%，4.91%。通过添加生物炭、有机肥使土壤重金属的固定增加，导致土壤有效态铅含量降低，增加了土壤残留铅含量。因为生物炭对土壤铅含量的固定量多于有机肥，因此，生物炭与接菌量配施处理土壤残留铅含量较多。

2.5 耐铅菌与不同吸附载体配施对土壤酶活性的影响

土壤酶活性一定程度上能够反映土壤的养分含量和受污染程度。从表7 可以看出，耐铅菌与2 种吸附载体配施后均能增加铅胁迫下土壤过氧化氢酶、蔗糖酶、磷酸酶、脲酶活性。2 种载体与不同接菌量配施处理后4 种酶活性均表现为先增大后减小，当接菌量为J2（0.5 g/kg）时，酶活性最大。T＋J2处理过氧化氢酶、蔗糖酶、磷酸酶、脲酶活性分别为1.674，4.258，0.053，0.451 mg/g；F＋J2 处理4 种酶活性分别为1.717，4.832，0.057，0.495 mg/g。

表7 耐铅菌与不同吸附载体配施对土壤酶活性的影响

从表7 还可看出，生物炭与不同接菌量配施处理后过氧化氢酶、蔗糖酶、磷酸酶、脲酶活性较CK分别增加0.92%～3.77%，2.70%～5.39%，6.14%～21.47%，4.68%～34.71%；有机肥与不同接菌量配施处理后4 种酶较CK 分别增加3.97% ～6.44%，11.28%～19.61%，14.39%～29.72%，30.00%～47.66%，4 种酶活性全部表现为F、J 配施处理较T、J 配施处理增加较大。可能是因为有机肥能改善土壤的呼吸作用，增强土壤微生物活性，促进土壤养分和能量转化，对铅污染土壤微环境有明显的改善作用[26]。杨继飞[27]研究发现，在铅污染土壤上施用菌肥、腐植酸，能降低重金属铅的毒害，提高植株含量，增加根际土壤中活性，施用菌肥和腐植酸可以达到修复铅污染土壤的目的。杨海征[28]研究发现，鸡粪堆肥一定程度上提高了重金属污染下茼蒿根际土壤中脲酶、过氧化氢酶、蔗糖酶和中性磷酸酶活性。郭文娟等[29]研究发现，在土壤中加入生物炭，均有增加土壤过氧化氢酶、脲酶、磷酸酶活性的作用，3 类酶分别增加10.2%～34.9%，18.0%～38.5%，0.7%～13.4%。

2.6 耐铅菌与不同吸附载体配施对土壤微生物区系的影响

土壤微生物作为土壤生物特性的重要组成部分，是评价土壤环境质量的指标之一，比较耐铅菌与不同吸附载体配施对微生物区系的影响（表8），结果表明，与CK 相比，不同处理土壤真菌、放线菌、细菌数量均显著增加。随接菌量的增加，耐铅菌与生物炭、有机肥配施后真菌、放线菌数量均表现为先增加后减少，在2 种载体分别与J2 配施时达到最大值。其中，T＋J2 处理真菌、放线菌分别较CK增加59.39%，49.47%，F＋J2 处理真菌、放线菌分别较CK 增加72.68%，59.10%。随着接菌量的增加，土壤细菌数量表现为递增趋势，2 种载体分别与J4 配施后达到最大值，T＋J4、F＋J4 处理较CK 分别增加1 322.43%，1 470.93%。随着接菌量的增加，土壤中细菌增加速度最快，主要是因为耐铅菌本身是细菌，能在土壤中大量繁殖。冯莉等[30]研究发现，利用荧光假单胞菌能够增加烟草根际土壤细菌和放线菌的数量，降低真菌的数量，这与本研究结果相似。3 类微生物数量均是F、J 配施处理较T、J 配施处理增加较多。这可能是因为有机肥含有丰富的碳水化合物和N、P、K 等矿质营养，可提高土壤通气性，不仅为微生物生长提供碳源和氮源，还能创造良好的生存环境，刺激土壤中微生物生长繁殖[31]。张连忠等[32]研究发现，有机肥施用可提高果园根区土壤细菌、放线菌、真菌的数量，有机肥还可明显减轻Cd、Cu 对土壤微生物的危害，减轻重金属对土壤的污染。

3 结论

当生物炭和有机肥作为载体分别以20 g/kg 添加量与0.5 g/kg 耐铅菌配施时对铅污染土壤修复效果最佳，有效减缓了铅对蔬菜的胁迫作用，显著促进油菜的生长，同时减少油菜体内铅富集，降低土壤有效态铅含量、增加土壤酶活性和微生物多样性。生物炭与有机肥作为外来营养源不仅能够作为耐铅菌的载体，提供微生物生长所需要的养分，显著改善土壤生态环境，还可以吸附重金属，提高生物强化技术对污染土壤的修复效果。