采用荧光显微技术对枣疯病病原进行鉴定

申仲妹，陈红玉，杨俊强，马光跃，薛新平，郭建民，孙锡峰，连永宏

（1.山西省农业科学院园艺研究所，山西太原030031；2.永和县林业局，山西永和041400）

枣疯病也称作“枣癌症”，它是一种由植原体所引起的维管束系统侵染性病害[1-8]。在枣树生产上典型症状表现为花变叶和丛枝，患病较轻的枣树会出现花脸果现象，严重时可导致树体死亡。经调查发现，目前山西省沿黄枣区都有枣疯病发病现象，有的地方枣疯病出现成片发病、全园发病、全园绝收的情况。目前该病原还未能进行离体培养。

本试验利用越冬期枝条水培方法，采用荧光染料（DAPI）染色技术，对条枣感病枝条和健康枝条的幼茎进行了对比诊断研究，旨在为快速、便捷、定性定量判断枣疯病病原提供技术支撑[9-13]。

1 材料和方法

1.1 试验材料

分别在2018 年1 月18 日、3 月9 日采集山西省临汾市永和县打石腰乡河浍里村枣园条枣的病枝和健枝用于水培试验。

1.2 试剂及仪器

5%戊二醛溶液（50%戊二醛用0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液稀释而成）、0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液（pH值7.0）（取磷酸二氢钾0.68 g，加0.1 mol/L 氢氧化钠溶液29.1 mL，用水稀释至100 mL 即得）、1.0 μg/mL DAPI（100 μg/mL DAPI 用0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液稀释而成）、1%霍兰格营养液。

落射式olympusDP72 荧光显微镜、BLC- 300 人工气候箱。

1.3 试验方法

1.3.1 越冬枝条的水培试验 水培液体分为蒸馏水、1%霍兰格营养液2 种。在200 mL 烧杯中放置5～8 枝30 cm 长条枣品种的枝条，分别加入100 mL水培液体。每隔2 d 换1 次水培液体，将原先的枝段用清水冲洗干净，将枝条末端剪成马蹄截面，再次放入新液体中。将烧杯放入人工气候箱中培养，使其萌发抽枝达3～5 cm，即可测定水培枝条的总枝条数、总芽数、萌芽数、成枝数。每个处理3 次重复。人工气候箱内环境条件为：温度25 ℃，湿度70%，光暗间隔时间分别为光照16 h，黑暗8 h。

1.3.2 DAPI 荧光显微检测观察[14]

1.3.2.1 试材固定 将水培后萌发的枣吊离体后固定在5%戊二醛溶液中，并保存在4 ℃冰箱中至少2 h 后待用。

1.3.2.2 切片 将试材从5%戊二醛溶液中取出并用清水冲洗干净，用崭新刀片将枣吊的幼嫩组织切成厚薄均匀的小圆片。

1.3.2.3 DAPI 染色 将40～50 片切片浸泡在为1.0 μg/mL DAPI 染色剂中染色15～20 min。

1.3.2.4 荧光显微观察 将染好色的切片15～20 片放置在载玻片上，加上盖玻片后用吸纸将四周液体吸干，将其放置在落射式olympus DP72 荧光显微镜下镜检，WU（紫光）激发，透射光365 nm，阻滤光420 nm，观测并拍照。

1.4 数据分析

数据经过Excel 2003 初步处理后，采用方差分析软件进行新复极差多重比较。

2 结果与分析

2.1 条枣品种越冬期枝条水培情况调查

从表1 可以看出，条枣的病枝与健枝通过水培后病枝萌芽率为32.7%，健枝的萌芽率为64.4%，相应的成枝率病枝为24.5%，健枝为47.5%；但从枝条芽数看，病枝芽数为98 个，健枝芽数为59 个，它们之间存在极显著差异，但是萌芽数与成枝数上二者间并不存在显著差异。究其原因，病枝患病后前期用于丛枝生长消耗大量枝条营养，从而导致越冬枝条形成的新芽不饱满，影响第2 年的正常生长。为了确保枣疯病病原的正常观测，建议试材用量为：30 cm 长的枝条，病枝数量至少是健枝数量的1 倍以上。

表1 条枣品种越冬期枝条水培情况调查

2.2 条枣品种越冬期枝条不同液体水培情况调查

表2 条枣品种越冬期枝条不同液体水培情况调查

从表2 可以看出，由于培养枝条的液体不同萌芽率也不同。病枝水培在蒸馏水中的萌芽数与水培在1%霍兰格营养液中的萌芽数之间不存在显著性差异，萌芽数稍低于水培在1%霍兰格营养液的病枝，它们的萌芽率分别为21.7%，39.7%；但是健枝水培在蒸馏水中的萌芽数与水培在1%霍兰格营养液的健枝存在极显著差异，健枝的萌芽率分别为64.4%，92.9%。试验也说明为了获取更多试验材料，通过补充外源营养物质可弥补枝条本身营养欠缺的遗憾。

2.3 DAPI 染色条枣嫩茎中植原体观察

经DAPI 染色后，在落射式olympusDP72 荧光显微镜下观察到，取自条枣病枝上的嫩茎横切片中的韧皮部有云片状或团状不规则的荧光带呈现，且不均匀分布（图1- A），而取自条枣健枝上的嫩茎横切片中的韧皮部荧光大小一致，分布均匀（图1- B）。

3 结论与讨论

王秀伶等[14]在鉴定枣疯病植原体的过程中强调，DAPI 是一种DNA 专化的荧光染料，当它与DNA 结合后会产生很强的荧光。植原体DNA 与DAPI 结合后产生的特异性荧光亮度大，且亮点有大有小，很不均匀，荧光亮点时常呈现团状或云片状。李成亮[15]研究认为，DAPI 本身的荧光极其微弱，但与DNA 结合后复合物的荧光度骤然上升，是检测DNA 的高效荧光染料。本试验结果与此相吻合。

条枣的病枝与健枝通过水培后从枝条芽数看，它们之间存在极显著性差异，但是从萌芽数与成枝数上二者并不存在显著性差异。究其原因，病枝患病后前期用于丛枝生长消耗大量枝条营养，从而导致越冬枝条形成的新芽不饱满，影响第2 年的正常生长。

由于培养枝条的液体不同，萌芽率也不同：病枝水培在蒸馏水中的萌芽数与水培在1%霍兰格营养液中的萌芽数之间不存在显著性差异，萌芽数稍低于水培在1%霍兰格营养液的病枝，它们的萌芽率分别为21.7%，39.7%；但是健枝水培在蒸馏水中的萌芽数与水培在1%霍兰格营养液的健枝相比它们存在极显著差异，健枝的萌芽率分别为64.4%，92.9%。试验也说明为了获取更多试验材料，通过补充外源营养物质可弥补枝条本身营养欠缺的遗憾。

本试验通过采集越冬期条枣品种枣疯病枝条对其进行水培，以正常枝条水培为对照，采用荧光显微技术（DAPI）对水培枝条的幼茎进行对比诊断研究，结果表明，越冬期枝条水培采集最佳时间为1 月；水培溶液为1%霍兰格营养液；试材需固定在5%戊二醛溶液放置4 ℃冰箱2 h 以上、1.0 μg/mL DAPI 染色剂中染色20 min，便可快速、便捷、定量定性判断枣疯病病原。DAPI 染色技术作为检测植原体侵染的一种手段，可在药物防治枣疯病的筛选研究工作中加以应用。