毛竹PeAMT2;1基因克隆及表达分析

娄永峰 欧阳承智 肖平江 袁婷婷

(1 江西省林业科学院 江西省植物生物技术重点实验室 南昌 330013; 2 安福县武功山林场 江西安福 343200; 3 国际竹藤中心竹藤资源基因科学研究所，国家林业和草原局/北京市竹藤科学与技术重点开放实验室 北京100102)

1 材料与方法

1.1 植物材料

以室内培养的盆栽毛竹实生苗为材料，培养条件：温度为18～25 ℃，光周期为16 h光照/8 h黑暗，光强为250～350 μmol/(m2·s)。新生毛竹实生苗长至2个月大小时，取其根、茎、叶等组织，用液氮速冻后，置于-80 ℃保存，用于后续总RNA的提取。

1.2 RNA提取及cDNA合成

利用Invitrogen公司的Trizol reagent提取毛竹新鲜材料的总RNA[8]，并根据大连TaKaRa公司的反转录试剂盒方法合成cDNA，于-20 ℃保存备用。

1.3 PeAMT2;1基因克隆

用水稻OsAMT1;1(AAL05612)和OsAMT2;1(AB051864)序列在NCBI数据库中检索，获得毛竹相关序列cDNA(FP095543)，并根据该序列设计引物AMT-001：5′-ATGGCGGCGGCCGGCGCGTACG-3′和AMT-501：5′-CTACAACTGGATGGTGACGCCCCTG-3′，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以毛竹cDNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系为20 μL：10 × LA Buffer 2.0 μL，dNTPs Mixture(2.5 mM each)2.0 μL，上下游引物(10 μM)各1.0 μL，cDNA 3.0 μL，LA Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)0.2 μL，加水至总体积20 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 1 min，68 ℃ 2 min，72 ℃ 2 min，35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物电泳检测后经DNA凝胶回收试剂盒回收，将回收产物与pMD19-T载体连接，并转化大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α菌株，筛选阳性克隆并鉴定，由生工生物工程(上海)股份有限公司完成测序。

1.3 生物信息学分析

将测序得到的序列在NCBI进行Blastp分析，并用Clustal W进行多重序列比对，用MEGA 6.0软件将其氨基酸序列与水稻等其他植物的AMT各亚类中的代表性成员进行聚类分析，构建系统进化树。

1.4 PeAMT2;1的表达检测

以毛竹根、茎、叶的cDNA为模板。根据克隆获得PeAMT2;1基因序列设计定量引物，AMT-RT-001：5′-TGCCTCGACGTCATCTTCTT-3′和AMT-RT-501：5′-CGTCGACCTTCATGATCAGC-3′。采用半定量RT-PCR分析PeAMT2;1基因的组织表达特异性。反应体系如下：10 × PCR Buffer(Mg2+plus)2.0 mL，dNTP Mixture(2.5 mM each)2.0 μL，AMT-RT-001(10 μM)1.0 μL，AMT-RT-501(10 μM)1.0 μL，cDNA 2.0 μL，rTaq(5 U/μL)0.2 μL，H2O 11.8 μL。反应过程：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性 30 s，61 ℃退火 30 s，72 ℃延伸1 min，25个循环；72 ℃延伸，10 min。同时以PeActin基因为内参对[9]。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，用ALPHAIMAGE 2000采集图像进行分析。

2 结果和分析

2.1 PeAMT2;1基因克隆及序列分析

通过同源序列比对检索，在NCBI数据库中获得了一条与水稻OsAMT2;1同源的毛竹基因序列(FP095543)，该序列全长1 776 bp，其中5′非编码区(UTR)长66 bp，3′ UTR长252 bp，编码区(ORF)长1 458 bp。在NCBI中进行进一步序列比对分析，发现该序列与水稻、二穗短柄草(Brachypodiumdistachyum)、大麦(Hordeumvulgare)等单子叶植物的AMT2亚类序列具有较高同源性。以毛竹cDNA为模板，用引物AMT-001和AMT-501进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳结果获得一条约1 400 bp的特异目的片段(图1)。测序结果分析表明，该片段大小为1 458 bp，与FP095543的ORF序列的一致性为99.04%，仅有14个碱基位点存在差异，这表明获得的目的片段为一个具有完整ORF的新毛竹基因的序列，因此命名为PeAMT2;1。

M：DNA分子量标准；1—3：PCR扩增产物。图1 毛竹PeAMT2;1基因PCR扩增

序列分析表明，PeAMT2;1编码一个含485个氨基酸的蛋白质，预测蛋白分子量为51.62 kD，理论等电点为8.23。利用NCBI中的保守结构域数据库对该蛋白的保守结构域进行预测，发现该蛋白属于典型的铵转运蛋白。通过TM predict软件对蛋白序列的跨膜区进行分析，发现PeAMT2;1蛋白具有11个跨膜区域，同时它们的N端和C端分别位于膜外侧和内侧(图2)。

At：拟南芥(Arabidopsis thaliana)；Bd：二穗短柄草(Brachypodium distachyum)；Pe：毛竹(Phyllostachys edulis)；Os：水稻(Oryza sativa)；TM1—TM11表示11个跨膜区域。图2 PeAMT2;1氨基酸序列与其他其同源序列的比对

2.2 PeAMT2;1系统进化分析

从NCBI网站下载水稻、小麦、拟南芥等不同物种AMT基因编码的氨基酸序列，利用Clustal X进行同源性比对分析，并用N-J法构建系统进化树(图3)。结果表明，所有物种的AMT家族成员被分为AMT1和AMT2两个亚家族，其中PeAMT2;1属于AMT2亚家族，且PeAMT2;1与水稻OsAMT2;1的亲缘关系最近，并且二穗短柄草BdAMT2;1、玉米ZmAMT2;1和谷子SiAMT2;1等单子叶植物的ATM2成员聚类在同一进化分支上，而与ATM1亚家族的成员距离较远。

At：拟南芥(Arabidopsis thaliana)；Bn：欧洲油菜；Bd：二穗短柄草(Brachypodium distachyum)；Lj：百脉根(Lotus japonicus)；Pe：毛竹(Phyllostachys edulis)；Pm：稷(Panicum miliaceum)；Os：水稻(Oryza sativa)；Ph：哈氏黍(Panicum hallii)；Si：谷子(Setaria italica)；Sl：番茄(Solanum lycopersicum)；Ta：小麦(Triticum aestivum)；Zm：玉米(Zea mays)。图3 基于AMT基因编码氨基酸序列构建的系统进化树

2.3 PeAMT2;1表达分析

提取毛竹根、茎、叶等组织的总RNA，并将其反转录为cDNA作为模板，通过半定量RT-PCR检测PeAMT2;1基因在毛竹不同组织的表达特性。结果表明(图4)，PeAMT2;1在毛竹根、茎、成熟叶和未完全展开的新叶中均有表达，其中在根和茎中的表达相对高于叶中，而在未完全展开的新叶中相对表达量也高于成熟叶。

1：根；2：茎；3：成熟叶；4：未完全展开的新叶。图4 PeAMT2;1在毛竹根、茎、叶中的RT-PCR分析

3 讨论

植物中AMT家族依据其同源性特征，被划分为AMT1和AMT2两个亚家族，其中AMT1亚家族为植物所特有，该亚家族成员与拟南芥AtAMT1具有较高的同源性，而AMT2亚家族与原核生物的铵转运蛋白具有较高的同源性，而与植物种属AMT1亚家族的同源性较低[1, 10-11]。虽然AMT基因在多种植物中已被克隆和鉴定，但在竹类属植物中尚未见报道。本研究先通过比对在NCBI中数据库检索得到了毛竹AMT同源基因序列，并根据该序列克隆了一个新的基因PeAMT2;1。氨基酸序列比对和系统进化树分析表明，PeAMT2;1编码的蛋白属于植物铵转运蛋白的AMT2亚家族，且与毛竹FP095543编码蛋白的一致性为97.73%，是一个新的毛竹铵态氮转运蛋白。

已有研究表明，水稻OsAMT2;1的表达在根系、叶片、叶鞘以及生殖器官的内外稃中表达较强，而在茎秆中的表达较弱，且其根系与地上部的表达均受外界氮源(铵)的诱导[12]。PeAMT2;1与OsAMT2;1的一致性为87.42%，聚类分析中与OsAMT2;1聚类到最近的分支，表明它们可能具有相似的功能。半定量RT-PCR分析表明，PeAMT2;1在根、茎、叶等组织中均表达，且在根和茎中表达相对高于叶中，这与OsAMT2;1在各组织的表达特点基本一致，进一步支持了它们可能具有相似的功能。但是，同属于AMT2亚家族的TaAMT2;3a在小麦叶中的表达显著高于根、茎[13]，其原因有待进一步探究。此外，研究表明AtAMT2;1和OsAMT2;1等部分AMT2亚家族成员基因的表达受到外界氮源的影响[12,14]，而毛竹PeAMT2;1对外界氮源变化的应答模式则仍需进一步研究。