2株芝麻真菌病害生防菌的抑菌特征、促生评价及鉴定

何碧珀，赵 辉，刘红彦，倪云霞，文 艺，刘新涛

(河南省农业科学院 植物保护研究所/农业部华北南部农作物有害生物综合治理重点实验室/河南省农作物病虫害防治重点实验室，河南 郑州 450002)

芝麻是世界上重要的优质油料作物，也是我国主要的油料作物之一，其种子油脂含量高且含有丰富的抗氧化物质[1-7]。在我国主要产区，芝麻茎点枯病、棒孢叶斑病、蠕孢叶斑病、枯萎病、球黑孢叶枯病等发生普遍，对芝麻生产造成了严重的影响[8]。目前，对芝麻真菌病害的防治主要以化学农药为主[9-11]，但随着人们生态环境保护和食品安全意识的不断提高，生物防治因其不易使病原菌产生抗药性，对人畜安全，有利于环境保护等特点，成为植物病害防治的重要发展方向之一。

芽孢杆菌具有较强的抗逆能力和安全性，其在生物防治领域作为植物病害生防菌得到了广泛的研究和应用。江苏省农业科学院植物保护研究所筛选的枯草芽孢杆菌Bs-916，对水稻纹枯病田间防效稳定在60%～81%，已进行农药登记[12]；北京绿色农华作物科技有限公司以贝莱斯芽孢杆菌Bv 01发酵液为活性成分研发的杀菌剂，能有效防治小麦赤霉病、花生白绢病和花生猝倒病，已获得专利保护[13]。美国Agraquest公司利用枯草芽孢杆菌QST 713和QST 2808开发的活菌剂Serenade TM和Sonata AS已在美国登记使用，用于防治土传的丝核菌和镰刀菌[14]；MARTINEZ等[15]用贝莱斯芽孢杆菌AH2制成的杀菌剂，不仅可以有效防治真菌性病害，还可刺激植物生长。目前，关于芽孢杆菌在芝麻真菌病害防治方面的报道较少，且这些报道多数只针对单一病害。本研究以5种芝麻常见病原真菌为靶标，对从采集的412份土壤样品中筛选出的2株生防菌SFB34和SFB109进行了广谱抑菌活性测定和促生评价，并通过形态观察、生理生化和分子生物学相结合的方法对菌株进行鉴定，为将菌株作为重要生防因子开发和研究提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 培养基

LB：胰蛋白胨10 g、酵母浸出物5 g、NaCl 5 g、琼脂15 g、蒸馏水1 000 mL；PDA：新鲜马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂粉20 g、蒸馏水1 000 mL。

1.2 供试菌株

1.2.1 生防菌株及来源 2株生防菌：SFB34、SFB109，是前期从采集的412份土壤样品中筛选出的，其中SFB34分离自栾川县白岩寺村，SFB109分离自栾川县秋扒乡雁坎村。

1.2.2 供试病原真菌及来源 供试病原真菌：球黑孢(Nigrosporasphaerica)、多主棒孢(Corynesporacassiicola)、索氏平脐蠕孢(Bipolarissorokiniana)、尖镰孢(Fusariumoxysporum)、菜豆壳球孢(Macrophominaphaseolina)，由河南省农业科学院植物保护研究所生防实验室保存。

1.3 生防菌抑菌作用测定

采用PDA平板对峙法测定菌体的抑菌活性。在90 mm平板中央接种病原真菌作为指示菌，菌饼直径6 mm，将生防菌接种在距指示菌2.5 cm的位置，以只接种病原真菌的平板为对照，每个处理重复3次。待对照菌直径介于7.5～8.0 cm时，用十字交叉法测定指示菌菌落半径(Rc)和对峙培养的趋向半径(Rp)，计算抑菌率[16]。抑菌率=(Rc-Rp)/Rc×100%。

采用含毒介质法[17]测定菌株拮抗物质的抑菌作用。PDA培养基冷却至45 ℃左右时，以发酵液滤液∶培养基=1∶3加至过滤的发酵液，充分混匀，倒板。待培养基凝固后，接种直径6 mm的病原真菌菌饼于平板中央，以只接种病原真菌的平板为对照，每个处理重复3次。待对照菌菌落直径介于7.5～8.0 cm时，测量对照和处理菌落直径，计算抑菌率。抑菌率=(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-6)×100%。

1.4 促生作用测定

1.4.1 生防菌菌悬液制备 挑取活化好的生防菌单菌落到LB培养基中，28 ℃、180 r/min恒温培养48 h，8 000 r/min离心10 min收集菌体，用无菌水洗2～3次，用血球计数板计数，将菌悬液稀释到5×108cfu/mL。

1.4.2 生防菌对芝麻苗的促生作用测定 以芝麻为指示植物，采用盆栽方式，挑选饱满的芝麻种子在28 ℃恒温培养箱中催芽24 h后播种于无菌土壤中。待芝麻苗生长到两叶一心时定苗，每盆留4棵长势一致的芝麻苗。设置2个处理，处理1为空白对照(CK)，用无菌水灌根，每株灌5 mL；处理2用5×108cfu/mL菌悬液灌根，每株灌5 mL。每个处理16棵芝麻苗，重复3次。将处理好的芝麻苗放置于光照温室中，28～32 ℃培养，定期浇水。培养21 d后调查芝麻苗的生长情况，记录株高、根长、鲜质量以及干质量。

1.5 生防菌鉴定

1.5.1 形态观察和生理生化测定 观察生长于LB平板上的菌株的菌落形态；通过革兰氏染色观察其个体特征；参照《常见细菌系统鉴定手册》[18]测定菌株SFB34和SFB109的生理生化相关指标。

1.5.2 分子鉴定 生防菌的全基因组利用CTAB法提取。PCR扩增引物采用细菌通用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR扩增采用25 μL体系：Mix 12.5 μL、引物各1 μL、模板DNA 1 μL、ddH2O 9.5 μL。PCR扩增条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s， 54 ℃退火1 min，72 ℃延伸60 s，循环30次；72 ℃再延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶检测后送郑州尚亚公司测序。将获得的序列利用BLAST程序与GenBank中核酸数据进行同源性比对，检索出相似性高且具有代表性的菌株。用BioEdit 7.0软件对其进行多重比对，再用MEGA 4.0软件以邻接法(NJ)构建系统发育树，进一步对生防菌株进行鉴定。

1.6 数据处理

用Excel 2013、DPS 7.5软件对数据进行处理。

2 结果与分析

2.1 芝麻真菌病害生防菌株SFB34和SFB109抑菌效果

平板对峙试验结果表明，菌株SFB34和SFB109对供试的5种芝麻病原真菌抑菌效果较好(图1)，抑菌率均大于50%(表1)。SFB34抑菌率由大到小排序：球黑孢(75.00%)>多主棒孢(67.86%)>索氏平脐蠕孢(60.00%)>尖镰孢(56.43%)>菜豆壳球孢(54.71%)；SFB109抑菌率由大到小排序：多主棒孢(71.79%)>索氏平脐蠕孢(62.65%)>菜豆壳球孢(61.18%)>尖镰孢(55.71%)>球黑孢(55.00%)。

1—5：阳性对照依次为菜豆壳球孢、尖镰孢、索氏平脐蠕孢、多主棒孢、球黑孢真菌；6—10：依次接入菜豆壳球孢、尖镰孢、索氏平脐蠕孢、多主棒孢、球黑孢真菌，再分别接入SFB34；11—15：在含SFB34发酵液滤液的培养基上依次接入菜豆壳球孢、尖镰孢、索氏平脐蠕孢、多主棒孢、球黑孢真菌；16—20：依次接入菜豆壳球孢、尖镰孢、索氏平脐蠕孢、多主棒孢、球黑孢真菌，再分别接入SFB109；21—25：在含SFB109发酵液滤液的培养基上依次接入菜豆壳球孢、尖镰孢、索氏平脐蠕孢、多主棒孢、球黑孢真菌1—5: The positive control is Macrophomina phaseolina,Fusarium oxysporum,Bipolaris sorokiniana,Corynespora cassiicola and Nigrospora sphaerica in

含毒介质试验结果见表1，菌株SFB34和SFB109的发酵液滤液抑菌率分别介于47.13%～88.89%、38.84%～86.90%，其对菜豆壳球孢、索氏平脐蠕孢和球黑孢的抑菌率均在83%以上；菌株SFB34对尖镰孢、多主棒孢的抑菌率分别为47.13%、59.33%，SFB109对尖镰孢、多主棒孢的抑菌率分别为38.84%、69.49%，2个菌株对尖镰孢和多主棒孢的抑菌率较低，与其对菜豆壳球孢、索氏平脐蠕孢和球黑孢的抑菌率差异均达到显著水平。

表1 2种生防菌对芝麻病原真菌的抑菌率Tab.1 Inhibition rates of two biocontrol bacteria against sesame pathogenic fungi

注：同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同。

Note: Different lowercase letters in the same column indicate significant difference (P<0.05). The same below.

2.2 芝麻真菌病害生防菌株SFB34和SFB109对芝麻苗的促生效果

促生效果测定结果表明(图2)，21 d后2株生防菌对芝麻苗的生长均表现出一定的促生作用。与对照相比(表2)，SFB34和SFB109对芝麻苗的株高和鲜质量均有较大影响，株高分别增长了8.91%、8.57%，鲜质量分别增长了28.02%、20.88%，与对照相比差异均达到显著水平。SFB34对芝麻苗的根长影响较大，根长增长了22.42%，与对照相比差异达到显著水平；而SFB109对芝麻苗的根长影响较小，根长增长了13.16%，与对照相比差异未达到显著水平。SFB34和SFB109对芝麻苗的干质量均有较大影响，干质量分别增长了23.52%、11.76%，与对照相比差异达到显著水平。综上所述，5×108cfu/mL的SFB34和SFB109菌悬液对芝麻促生效果明显。

图2 菌株SFB34和SFB109对芝麻苗的促生效果Fig.2 Promoting effects of strains SFB34 and SFB109 on sesame seedlings

表2 菌株SFB34和SFB109菌悬液对芝麻幼苗生长的影响Tab.2 Effects of suspension of SFB34 and SFB109 on the growth of sesame seedlings

2.3 芝麻真菌病害生防菌株SFB34和SFB109的鉴定

形态学观察结果显示(图3)，菌株SFB34和SFB109菌体呈杆状，产芽孢，革兰氏染色均呈阳性，在LB平板上菌落乳白色，边缘不整齐，表面干燥，不透明，SFB109表面有褶皱和凸起。由表3可知，SFB34和SFB109的甲基红试验、乙酰甲基甲醇试验、过氧化氢酶试验、明胶水解试验、精氨酸双水解试验、淀粉水解试验、纤维素水解试验、酪氨酸水解试验、葡聚糖水解试验均为阳性，几丁质水解试验均为阴性。碳源利用方面的试验表明，SFB34和SFB109均可利用蔗糖、D-葡萄糖、D-果糖，SFB34还可以利用麦芽糖、乳糖、D-木糖、甘油、D-山梨醇和D-甘露醇，而SFB109则无法利用。参照文献[7]，结合菌株SFB34和SFB109的形态特征、染色结果和生理生化测定结果，可判定SFB34和SFB109为芽孢杆菌。

A：SFB34菌落形态; B：SFB109菌落形态; C：SFB34革兰氏染色; D：SFB109革兰氏染色

项目ItemSFB34SFB109项目ItemSFB34SFB109甲基红试验Methyl-Redtest++碳源利用试验:麦芽糖Carbonsourceutilizationtest:Maltose+-乙酰甲基甲醇试验Voges-Proskauertest++碳源利用试验:乳糖Carbonsourceutilizationtest:Lactose+-过氧化氢酶试验Catalasetest++碳源利用试验:蔗糖Carbonsourceutilizationtest:Sucrose++明胶水解试验Gelatinhydrolysatetest++碳源利用试验:D-葡萄糖Carbonsourceutilizationtest:D-Glucose++精氨酸双水解试验Argininedihydrolysistest++碳源利用试验:D-木糖Carbonsourceutilizationtest:D-Xylose+-淀粉水解试验Starchhydrolysistest++碳源利用试验:D-果糖Carbonsourceutilizationtest:D-Fructose++几丁质水解试验Chitinhydrolysistest--碳源利用试验:甘油Carbonsourceutilizationtest:Glycerol+-纤维素水解试验Cellulosehydrolysistest++碳源利用试验:D-山梨醇Carbonsourceutilizationtest:D-Sorbitol+-酪氨酸水解试验Tyrosinehydrolysistest++碳源利用试验:D-甘露醇Carbonsourceutilizationtest:D-Mannitol+-葡聚糖水解试验Dextranhydrolysistest++

注：+表示阳性；-表示阴性。

Note: + means positive; - means negative.

将菌株SFB34和SFB109用细菌16S rDNA通用引物27F/1492R进行PCR扩增后测序，序列长度分别为1 422、1 436 bp。经GenBank数据库同源性比对发现，菌株SFB34和贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis，登录号为MK_156148.1、MK_610724.1) 的16S rDNA核苷酸序列同源性最高，最大相似度为100%；菌株SFB109和枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis，登录号为：MH_187616.1)16S rDNA核苷酸序列同源性最高，最大相似度为98.89%。根据16S rDNA序列同源性构建的系统发育树(图4)表明，SFB34与贝莱斯芽孢杆菌聚为一支，SFB109与枯草芽孢杆菌聚为一支。因此，根据同种细菌同源性相似度不低于98.65%的标准[19]，结合系统发育树，SFB34和SFB109分别被鉴定为贝莱斯芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌。

图4 基于16S rDNA序列同源性分析构建的菌株SFB34和SFB108系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree of SFB34 and SFB108 based on 16S rDNA sequence homology analysis

3 结论与讨论

在芝麻真菌病害生防菌的筛选过程中，发现菌株SFB34和SFB109有良好的抑菌效果，通过生理生化、形态观察和分子生物学相结合的方法，将菌株SFB34和SFB109分别鉴定为贝莱斯芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌。芽孢杆菌具有抑菌谱广、繁殖能力和抗逆性强、防病促生等基本特性，被广泛应用于植物病害生物防治领域。贝莱斯芽孢杆菌是芽孢杆菌属的一个新种，具有促进植物生长、产生抗真菌代谢产物以及在植物上高效定殖的特点，许多菌株在农业生产中被用作植物病原菌的拮抗剂和植物生长促进剂[20]。贝莱斯芽孢杆菌对梨灰霉和青霉病菌[21]、小麦赤霉病菌[22]、小麦白粉病菌[23]、马铃薯枯萎病菌[24]、稻瘟菌[25]等植物病害有很好的拮抗效果；KANJANAMANEESATHIAN等[26]将贝莱斯芽孢杆菌制成的悬浮剂直接应用于莴苣幼苗，发现其不仅能有效控制莴苣根腐病，还能促进莴苣生长；蔡长平等[27]报道贝莱斯芽孢杆菌PEB-99不仅对辣椒青枯雷尔氏菌、辣椒疫霉菌和辣椒炭疽病菌等有显著抑菌效果，该菌还能产生铁载体和吲哚-3-乙酸，溶解有机磷，显示出很好的抗病促生长潜力。枯草芽孢杆菌是世界农药市场上近一半生物农药的活性成分，被广泛应用于棉花、小麦、水稻、辣椒等作物真菌病害的生物防治[28]。LEE等[29]研究发现，枯草芽孢杆菌21-1不仅能提高种子发芽率，还能有效防治黄瓜叶片炭疽病、番茄灰霉病、大白菜和生菜软腐病；YU等[30]研究发现，枯草芽孢杆菌CAS15可使辣椒枯萎病降低12.5%～56.9%，还能将花期缩短一半，使辣椒株高增加27.24%～54.53%，单果质量增加36.92%，单株产量增加49.68%。本研究中平板对峙法和含毒介质法测定SFB34和SFB109对芝麻球黑孢、多主棒孢、索氏平脐蠕孢、尖镰孢和菜豆壳球孢5种病原真菌的抑菌效果表明，2个菌株均表现出较强抑菌活性，其中SFB34和SFB109的发酵液滤液对菜豆壳球孢、索氏平脐蠕孢和球黑孢的抑菌率达83%以上，高于菌体抑菌率，而SFB34和SFB109的发酵液滤液对多主棒孢和尖镰孢的抑菌率均低于菌体抑菌率，这可能是由于菌株在不同培养条件下产生的抑菌活性物质不同引起的。另外，用5×108cfu/mL的SFB34和SFB109菌悬液分别灌根处理芝麻苗后，与对照相比，芝麻苗的株高、鲜质量和干质量显著提高。

大量研究表明，芽孢杆菌能产生多种抑菌活性物质，主要有抑菌蛋白、抗生素、细胞壁溶解酶、细菌素以及挥发性物质等。本研究中的SFB34和SFB109具有纤维素水解、酪氨酸水解、葡聚糖水解的能力，并且其发酵液滤液对上述芝麻病原真菌也有很好的抑制效果，据此推测上述2个菌株的发酵液滤液中可能含有细胞壁溶解酶和一些抑菌蛋白等，具体活性物质成分还有待进一步研究。