‘蜜脆’苹果果皮和果肉香气差异

李 瑞，刘翠华，石金瑞，闫 丹，张 琪，刘潇然，任小林

(西北农林科技大学 园艺学院，陕西杨凌 712100)

果实品质由色泽、香气、质地、果形以及是否有病虫害等因素决定；其中果实香气能够使人放松，心情愉悦，解除人的身心疲劳与紧张，刺激食欲，是吸引消费者的重要品质之一[1]。国内外关于苹果香气的研究已经有50余年历史，期间有300多种香气物质被鉴定，主要为醇、醛、酯、酮、醚、萜类以及芳香族类化合物[2]。苹果的品种、成熟度、环境、栽培管理条件以及采后贮藏条件等均可影响果实香气的形成[3-4]，研究果实的香气对于提高果实品质，增加商品价值有重要的意义。

‘蜜脆’(Honeycrisp)苹果是由美国明尼苏达大学于1991年培育而成的中熟苹果新品种，因其果肉细脆、香味怡人而被广大消费者喜爱[5]，目前关于‘蜜脆’的研究主要集中于栽培管理、病虫害以及采后贮藏等方面，而对果实香气品质的研究较少[4-8]。香气组成和含量在同一果实的不同部位存在组织差异；如‘富士’苹果香气物质以2-甲基丁醇、顺-3-己烯醇、反-2-己烯醛以及2-甲基丁酸乙酯为主，其中顺-3-己烯醇和反-2-己烯醛在果皮中的含量显著高于果肉中的含量，但2-甲基丁酸乙酯在果皮和果肉中含量相当[9]。本研究利用有机溶剂(甲基叔丁基醚)萃取果皮和果肉中的香气物质，采用气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)，并基于标准物质进行定性定量，从而揭示‘蜜脆’果实果皮和果肉中香气成分的组成和差异，旨在为‘蜜脆’苹果品质评价以及研究苹果香气物质合成提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

‘蜜脆’果实于2016年9月15日采自宝鸡一果树生长状况良好的果园。果实采收后立即运往实验室，选择大小、色泽一致，无病虫害、无机械损伤的果实15 个，每5 个为一组；用削皮器削取果皮，厚度小于0.2 mm，液氮速冻，存于-80 ℃冰箱，用于果皮香气物质的分析；果肉用于果肉香气物质的分析，重复3 次。

1.2 标准品与试剂

内标3-壬酮(3-nonanone)购于Alfa Aesar公司(天津，中国)；用于测定保留指数(Retention Index,RI)的C7-C30饱和系列烷烃购于Supelco公司(罗夕法尼亚，美国)；用于提取挥发性物质的MTBE(HPLC级)购于Tedia公司(费尔菲尔德，美国)。挥发性标准物质的来源以及定量离子(Quantifying Ions，QI)、校正因子(Correction Factors，CF)见表1。

此外，以下挥发性标准物质也用于挥发性物质的定量，但是在本试验中并未检测到相应的成分，其中2-丁醇和乙酸苄酯购于Alfa Aesar公司(天津，中国)；2-甲基丁酸-2-甲基丁酯、2-戊醇和(E,E)-2,4-壬二烯醛购于Sigma-Aldrich公司(圣路易斯，美国)。

表1 香气物质GC-MS分析所用的标准物质Table 1 Authentic standard of aroma compounds used in GC-MS analysis

注：a来源.Sigma，Sigma-Aldrich 公司(圣路易斯，美国)； Alfa，Alfa Aesar公司(天津，中国)；Amatek，苏州爱玛特有限公司(苏州，中国)； b.保留指数.香气物质在VF-WAXms毛细管柱上的实测保留指数；c定量离子.在SIM模式下定量离子的质荷比；d响应因子.目标物质与相应内标的校正因子；-.未计算。

Note:a Source.Sigma.Sigma-Aldrich Co.Ltd.(St.Louis,MO,USA); Alfa,Alfa Aesar Co.Ltd.(Tianjin，China); Amatek,Amatek Scientific Co.Ltd.(Suzhou,China); b RI.actual retention index on VF-WAXms Column; c QI.the quantify ion of quantification ion under SIM mode; d IF.the correction factors for each compound vs.the corresponding internal standard; -.un-calculated.

1.3 方法

1.3.1 香气物质的提取 香气物质提取方法参考石金瑞等[10]并改进。将-80 ℃冻存的果实样品在液氮中进行研磨，使其成均匀的粉末状，称取2 g样品于10 mL的离心管内；并加入3 mL的蒸馏水，涡旋混匀；再加入3 mL的MTBE提取液和10 μL内标[V(3-壬酮)∶V(甲醇)=5∶ 30 000]，震荡摇匀后于超声波清洗仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)超声萃取(25 ℃)30 min；之后用D-37520型离心机(美国Thermo Fisher公司)离心(11 200 r/min，4 ℃)15 min；取上清液 2 000 μL，利用干式氮吹仪(杭州奥盛仪器有限公司)浓缩至500 μL，过滤后，取1 μL进行GC-MS分析。

1.3.2 果实香气物质的GC-MS分析 使用美国Thermo Fisher ISQ GC-MS气相色谱-质谱联用仪进行香气组分的分析。色谱条件：色谱柱为VF-WAXms柱，30 m×0.25 mm×0.25 μm弹性石英毛细管柱；进样口温度为230 ℃，不分流进样；升温程序为初温40 ℃保持3 min，后以 5 ℃/min升至150 ℃，再以8 ℃/min升至 220 ℃，保持10 min；载气为高纯度的氦气 (99.999%)，流速为1 mL/min。质谱条件：电子轰击离子源；电子能量70 eV；传输线温度 240 ℃；离子源温度240 ℃；激活电压1.5 V；质量扫描范围是33～380 m/z。

由GC-MS分析得到的原文件，利用Xcalibur(Thermo fisher scientific)与AMDIS (www.amdis.net)软件进行分析。定性分析：未知化合物的质谱图同NIST library 质谱库进行比对，并结合相应标准物质的保留时间与保留指数(Retention index，RI)确定香气物质，其中VF-WAXms柱上的RI是通过系列饱和链状烷烃(C7-C30)计算而得[11]。定量分析：香气物质质量分数基于各标准物质的校正因子(CF)计算而得，具体计算过程如下：CF=[(Cs/As)/(Ci/Ai)]，Cx=CF·Ax·Cxi/Axi。其中Cs为标准物质的浓度；As为选择离子模式下标准物质的面积；Ci为内标3-壬酮的浓度；Ai为3-壬酮的峰面积(QI=113)；Cx为待测物质的浓度；Ax为待测物质在选择离子模式下的峰面积，Cxi为待测样品中内标的浓度；Axi为待测样品中内标的峰面积(QI=113)。无标准物质的香气物质利用相似物质定量法进行定量[12]，利用相似物质定量的香气物质见表2。

香气值(OAV)是指某香气物质的浓度与该化合物香气阈值的比值，可通过计算OAV挖掘特征香气物质[13]。

表2 利用相似物质法定量的香气物质Table 2 Quantitate aroma compounds based on similar chemicals

注：a定量离子.在SIM模式下定量离子质荷比；b响应因子.目标物质与相应内标的校正因子。

Note:a QI.The quantify ion of quantification ion under SIM mode; b IF.the correction factors for each compound vs.the corresponding internal standard.

2 结果与分析

2.1 ‘蜜脆’果实果皮与果肉香气组成差异分析

利用气相色谱-质谱联用技术定性定量分析‘蜜脆’苹果果皮与果肉中的香气物质，共检测到42种香气物质，包括酯类、醇类、醛类、酸类、萜烯类和苯环类等6类物质(表3)，各类香气物质在果实中的分布存在很大差异。

果皮部分共检测出41种香气物质(表3)，总质量分数为35 786.10 μg/kg。酯类香气物质种类最丰富，有21种，质量分数为7 172.20 μg/kg，占果皮香气物质总量的20.4%(图1)；醇类香气物质次之，有9种，质量分数为18 175.29 μg/kg；醛类有4种，以C6醛类物质为主，占醛类香气物质总量的81.01%；萜烯类2种，分别为α-法呢烯和法尼醇；有机酸3种，含苯环类物质2种。

果肉中共鉴定出34 种香气物质，其中酯类香气物质种类最丰富(15种)，质量分数为4 367.56 μg/kg；醇类物质次之(9 种)，但其质量分数最高，为66 294.76 μg/kg，占果肉香气物质总量的 86.33%(图1)，以1-丁醇和1,3-辛二醇为主。其次，在果肉中还检测到醛类物质3种，质量分数为3 889.93 μg/kg，有机酸3种，苯环类物质3种，以及少量的α-法呢烯。

果皮与果肉中检测到相同的香气成分有34 种，其中酯类15 种，醇类9 种，醛类3 种，有机酸2 种，含苯环类物质2 种，萜烯类1 种。2 个部位中质量分数较高的香气成分均为醇类、酯类和醛类，但在同类物质中不同部位的质量分数以及物质组成存在很大差异(图1)。酯类物质中2-甲-丁酸丁酯、辛酸丁酯、辛酸3-甲基丁酯、辛酸己酯和癸酸丁酯是果皮中特有的酯类香气物质，支链酯类物质2-甲基丁酸乙酯、乙酸2-甲基丁酯和2-甲基丁酸丁酯等在果皮中的质量分数均高于果肉。果皮和果肉中醇类香气物质质量分数最高且种类相同，但果肉中检测到的每种醇类物质的质量分数均远高于果皮(图1)。‘蜜脆’果实中的醛类物质以C6醛为主，果皮中醛类物质的总量略高于果肉中的总量；其中己醛在果皮中质量分数是3 776.53 μg/kg，在果肉中质量分数是2 228.14 μg/kg，是果肉和果皮中质量分数最高的醛类物质，(E,E)-2,4-葵二烯醛是果皮中特有的醛类物质，质量分数为245.12 μg/kg。萜烯类香气物质只检测到2种，分别是α-法呢烯和法呢醇，主要分布在果皮中，质量分数为2 376.04 μg/kg，以α-法呢烯为主，而果肉中只检测到少量的α-法呢烯，未检测到法尼醇。除了以上4 类主要的香气物质外，还检测到4 种有机酸类物质，3种含苯类物质，二者在果肉、果皮中的质量分数差异不大；有机酸类物质中己酸是果皮中特有的物质，丙酸是果肉中特有的物质；含苯环类物质中苯乙醇是果肉中特有的物质。

表3 ‘蜜脆’果皮、果肉香气成分及其质量分数Table 3 Aroma compounds and mass fraction in the peel and flesh of ‘Honeycrisp’ apples

(续表3 Continued table 3)

物质Chemical保留指数ΙaRI Ι保留指数ΙΙbRI ΙΙ定性Qualitative 质量分数/(μg/kg)Mass fraction果皮Peel果肉Flesh3-羟基丁酸乙酯 Ethyl 3-hydroxybutyrate1 5101 515 nMS/RI229.34605.36∗∗己酸己酯 Hexyl hexanoate1 5991 602 nMS/RI/STD730.9229.98∗∗辛酸丁酯 Butyl n-octanoate1 6031 604 nMS/RI331.70-∗∗辛酸3-甲基丁酯 Isoamyl n-octanoate1 6491 658 nMS/RI98.68-∗∗3-羟基丁酸丁酯 Butyl 3-hydroxybutyrate1 6941 684 nMS/RI35.9988.89∗∗辛酸己酯 Hexyl caprylate1 7991 796 nMS/RI/STD139.47-∗∗葵酸丁酯 n-Butyl decanoate1 8071 812 nMS/RI69.93-∗∗总酯 Sum7 172.204 367.56∗∗醇类 Alcohols1-丙醇 1-Propanol1 0411 036 nMS/RI759.031 914.15∗∗2-甲基-1-丙醇 2-Methyl-propanol1 0911 092 nMS/RI/STD193.97441.51∗∗1-丁醇 1-Butanol1 1451 173[14]MS/RI/STD7 684.3222 776.59∗∗2-甲基-1-丁醇 2-Methyl-1-butanol1 2031 208 nMS/RI/STD1 241.473 739.82∗∗1-戊醇 1-Pentanol1 2501 250 nMS/RI/STD128.40275.01∗∗1-己醇 1-Hexanol1 3511 348[14]MS/RI/STD906.012 555.40∗∗6-甲基-5-庚烯-2-醇 6-Methyl-5-hepten-2-ol1 4591 465 nMS/RI/STD16.6931.35∗∗2,3-丁二醇 2,3-Butanediol1 5361 545 nMS/RI213.37410.59∗∗1,3-辛二醇 1,3-Octanediol2 128MS/STD7 032.0334 150.35∗∗总醇 Sum18 175.2966 294.76∗∗醛类 Aldehyde己醛 Hexanal1 0761 083 nMS/RI/STD3 776.532 228.14∗∗(E)-2-己烯醛 (E)-2-hexenal1 2111 216 nMS/RI/STD1 046.041 521.79∗∗壬醛 Nonanal1 3861 396[14]MS/RI/STD885.44140.01∗∗(E,E)-2,4-葵二烯醛 (E,E)-2,4-nonadienal1 7951 811 nMS/RI245.12-∗∗总醛 Sum5 953.143 889.93∗∗酸类 Acids乙酸 Acetic acid1 4631 449 nMS/RI522.13601.23丙酸 Propanoic acid1 5461 552[14]MS/RI/STD-448.34∗∗丁酸 Butanoic acid1 6321 626[14]MS/RI/STD107.0076.02∗∗己酸 Hexanoic acid1 8481 841[14]MS/RI/STD129.01-∗∗总酸 Sum758.141 125.59∗∗萜烯类 Terpenesα-法呢烯 α-Farnesene1 7401 746 nMS/RI/STD1 443.1276.02∗∗法尼醇 Farnesol2 3502 356 nMS/RI/STD932.92-∗∗总萜类 Sum2 376.0476.02∗∗苯环类 Benzenoid苯乙醇 Phenethyl alcohol1 9001 869[14]MS/RI-212.41∗∗苯酚 Phenol2 0032 000 nMS/RI1 159.01657.16∗∗2,4-叔丁基苯酚 2,4-Di-tert-butylphenol2 3092 318 nMS/RI192.29164.44总 Sum1 351.311 034.01香气物质总量/(μg/kg) Total volatile 35 786.1176 787.88∗∗

注：a保留指数Ⅰ,香气物质在VF-WAXms色谱柱上的实测保留指数；b保留指数Ⅱ.参考资料中香气物质在VF-WAXms 色谱柱上的保留指数；n,NIST质谱库中香气物质在极性色谱柱上保留指数的平均值；MS.通过与NIST质谱库质谱比对进行定性；RI,通过保留指数进行定性；STD.通过标准品进行定性；-.未检测到；利用独立样本T检验，*表示P<0.05，**表示P<0.01。

Note:aRI Ⅰ.Actual retention index on VF-WAXms column; bRI Ⅱ.reference retention index on VF-WAXms column from reference; n.the average values of retention index in polar column from NIST MS Search; MS.qualitative by comparing the mass spectrometry with the NIST library; RI.qualitative by RI; STD.qualitative by standard substance; -.not detected; independent t-test,*P<0.05， **P<0.01.

**表示数据经独立样本t检验差异极显著(P<0.01) ** Means significant difference at 0.01 level byt-test

图1 ‘蜜脆’苹果果皮和果肉中各类香气成分占总香气成分百分比
Fig.1 Various aroma compounds percent of total aroma in the peel and flesh of ‘Honeycrisp’ apple

主成分分析是利用降维的思想，将多个指标转化为几个综合指标的多元统计方法。基于‘蜜脆’苹果果皮和果肉中香气成分的质量分数，使用SPSS软件进行主成分分析，并作图(图2)。主成分分析结果显示，当提取两个主成分时可以解释原始变量总方差的94.26%，其中第一主成分(PC1)解释总方差的90.45%，第二主成分(PC2)解释总方差的3.81%。图2显示‘蜜脆’苹果香气成分在果皮与果肉的分布存在很大的差异，且引起差异的主要是PC1。由表4可得，PC1的线性组合为：PC1=0.06x1-0.15x2+0.16x3+…-0.16x40+0.14x41+0.05x42，除乙酸丙酯、辛酸丁酯和2,4-叔丁基苯酚外，其他变量的系数绝对值相当。PC1的线性组合的系数中，14个酯类的系数，除E-2-己烯醛外所有醛类系数以及两个萜物质的系数均为正；而所有醇类物质变量的系数均为负。因此根据主成分分析的结果可知，‘蜜脆’苹果果皮与果肉中香气成分的差异主要表现在酯类、醇类、醛类以及萜类物质。结合果皮和果肉中香气成分的质量分数可知，酯类、醛类、萜类物质集中分布在果皮，而醇类物质主要分布在 果肉。

圆点、下轴、左轴构成每种香气成分的载荷图 Load diagram of each aroma component with the circle,lower axis and left axis；三角形、五角星、上轴、右轴构成果皮与果肉的主成分得分图 Principal component score map of peel and flesh composed of the triangle,pentagon,upper axis and right axis

图2 ‘蜜脆’果皮与果肉中42种香气成分主成分分析
Fig.2 Principle component analysis (PCA) of 42 aroma compounds
determined in the peel and flesh of ‘Honeycrisp’ apples

2.2 ‘蜜脆’果实果皮与果肉香气值差异分析

果皮中lg(OAV)>0的物质有18 种(表5)，酯类物质有丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、乙酸丁酯、己酸乙酯、乙酸己酯、2-甲基丁酸己酯和己酸己酯等12 种酯类物质，其中2-甲基丁酸乙酯的香气值最高为27 125.34，香气贡献率为88.65%，是果皮中主要的呈香物质，该物质呈水果香。醛类与醇类物质有1-丁醇、2-甲基-1-丁醇、己醛、(E)-2-己烯醛和壬醛，其中壬醛的香气贡献率仅次于2-甲基丁酸乙酯(2.89%)，呈花香。

果肉中lg(OAV)>0的物质有16 种(表5)，酯类物质有9种，其中2-甲基丁酸乙酯的香气值最高为14 842.10，香气贡献率为87.93%，是果肉中主要的呈香物质，其次为呈果香的丁酸乙酯，香气贡献率为5.63%。果肉中lg(OAV)>0的醇类香气物质为2-甲基-1-丙醇、丁醇、2-甲基-1-丁醇和己醇，果肉中虽醇类物质总量最高，但由于醇类物质的香气阈值较高，导致醇类物质的香气贡献率累积不到1%。果肉中lg(OAV)>0的醛类为己醛、(E)-2-己烯醛和壬醛。

虽然果皮与果肉之间香气物质的质量分数以及组成存在很大差异，但二者香气值之间差异不明显，主要的呈香物质均为酯类物质，其中呈果香的2-甲基丁酸乙酯的香气贡献最高。

表4 ‘蜜脆’果皮与果肉中42种香气成分主成分分析因子载荷矩阵Table 4 Component matrix of principle component analysis (PCA) of 42 volatile compounds determined in the peel and flesh of ‘Honeycrisp’ apples

3 讨 论

‘蜜脆’苹果果皮中酯类和醛类物质的质量分数比果肉中的高，且种类更丰富；但果皮中醇类物质的质量分数低于果肉；这可能与果肉和果皮中相关合成底物、酶基因的表达量以及酶活性的差异相关。醇和酰基-CoA在醇酰基转移酶(AAT)的作用下合成酯是酯类物质合成的最后一步，是一个需氧过程；因此，AAT在果皮的活性较高[3]；这可能是‘蜜脆’果皮酯类香气物质质量分数高的一个原因。脂氧合酶(LOX)对多元不饱和脂肪酸例如亚油酸、亚麻酸有双加氧作用，生成相应的过氧化物，然后在脂氢过氧化物裂解酶(HPL)作用下生成C6醛[20]；ECHEVERRI等[21]在研究‘富士’苹果成熟过程中香气成分的变化中发现：在果皮中脂氧合酶(LOX)活性显著高于果肉；因此，‘蜜脆’果皮中以C6醛为主的醛类物质的质量分数高于果肉，可能是由于LOX在果实中不同部位的酶活性差异导致的。

表5 ‘蜜脆’果皮、果肉香气成分香气值的常用对数值Table 5 Volatile components lg(odor unit)in the peel and flesh of ‘Honeycrisp’ apples

注:alg(香气值).香气值为某种化合物含量与该化合物香气阈值的比值，lg(香气值)= lg(化合物含量/香气阈值)，lg(香气值)>0的挥发性物质被认为是该果实的特征香气成分；b香气贡献.香气贡献值为某种化合物的香气值与总香气值的比值。

Note:alg(odor unit).The compound odor unit is the ratio of content to aroma threshold,lg (odor unit) = lg (amount / OTH),the volatile component with lg (odor units) >0 is regarded as the characteristic aroma components of the fruit; bAroma contribution.the aroma contribution is the ratio of aroma value of a compound to total aroma value.

支链酯类物质(2-甲基丁酸乙酯、乙酸2-甲基丁酯和2-甲基丁酸丁酯等)在果皮中的质量分数均高于果肉。在苹果中，支链酯类物质主要来自于支链氨基酸亮氨酸、缬氨酸以及异亮氨酸的代谢[2]。前人研究结果表明，苹果果实中氨基酸和脂肪酸在果皮中的含量高于果肉，尤其是异亮氨酸[9]；‘乔纳金’苹果在成熟衰老过程中，果实内异亮氨酸与其他氨基酸的变化趋势不同，但与乙烯和支链酯类物质的变化趋势一致[22]；因此，‘蜜脆’果肉和果皮中支链酯类物质的差异可能不仅与AAT酶活性的差异有关，也可能与生成支链酯的底物-支链氨基酸在果实中的分布不均有关。

根据人们对不同香气成分的感官效果，水果的香气可分为果香型、甜香型、青香型、辛香型、木香型和醛香型等[23]。苹果根据果实芳香物质的组成分为以‘金冠’[24]为代表的“酯香型”、以“乔纳金”[25]为代表的“醇香型”以及以“澳洲青苹[26]”为代表的“青香型”[27]。“酯香型”苹果可根据酯类物质的组成分为乙酸酯型、丙酸酯型、丁酸酯型及乙醇酯型[28]；如‘富士’香气物质以乙酸丁酯、乙酸己酯和2-甲基丁基乙酸酯为主，是典型的“乙酸酯型”[21]。本研究中，酯类物质是影响‘蜜脆’果实香气品质的主要物质，其香气值在果皮和果肉中分别占总香气值的94.21%和 95.62%。虽然在‘蜜脆’果皮和果肉中醇类物质质量分数最高，但是酯类物质香气贡献值最高，原因是酯类物质的气味阈值远低于醇类物质。因此，‘蜜脆’苹果应归入‘酯香型’苹果类型。同时本研究结果表明，丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、己酸乙酯等9种酯类物质，为‘蜜脆’果皮和果肉共有的酯类特征香气物质，其中呈典型果香的2-甲基丁酸乙酯在果皮和果肉中香气贡献值最高，其次为丁酸乙酯；因此‘蜜脆’苹果属于“酯香型”苹果的“乙醇酯型”。

4 结 论

采用有机溶剂萃取法并结合气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术，对‘蜜脆’苹果不同组织的香气成分进行分析，共检测到42种香气成分，包括酯类、醇类、醛类、酸类、萜类和含苯环类物质；其中酯类、醛类和醇类物质是果皮的主要香气成分，醇类物质为果肉的主要香气成分。综合香气物质谱及香气值分析，将‘蜜脆’苹果归于‘酯香型’苹果的“乙醇酯型”品种。