魔芋精粉中葡甘聚糖含量的测定

李 浪，李茂纤，叶 坪，张泽俊，李俊杰，龚健康

(昭通学院 化学化工学院,云南 昭通 657000)

魔芋，其学名为蒟蒻(学名Amorphophallus konjac，简称Konjac)，又名磨芋、花梗莲、蛇六谷、鬼芋等，中国古代又称妖芋，为天南星科植物[1]。我国魔芋资源属于比较丰富的国家之一，有2000多年的栽培历史，最早栽种是在我国的西南地区，我国目前栽种品种共有21种，它们主要是分布在福建、台湾、陕西、四川、湖北、安徽、浙江、云南等地，主要种植有两个品种白魔芋和花魔芋[2]。目前全球魔芋栽种主要集中分布在印度尼西亚、缅甸、中国、越南、日本等国。魔芋多生长于疏林下、林缘以及溪谷两旁湿润地，多生长于海拔310m至2200m 的地区。根据中国魔芋区划分区[3]，云南魔芋最适宜种植区是昭通市，它拥有全国优质金江白魔芋(葡甘聚糖含量高达74.04%远远高于国家一级>68%的标准)原产地和主产区[4-6]，金沙白魔芋是全国魔芋最优良的品种具有很大的研究价值。目前由昭通生产的魔芋精粉销往国内、日本和越南等地。

魔芋是一种传统食品，具有低热量、低脂肪和高纤维的优良食品。魔芋中的膳食纤维对人体营养平衡调节有重要作用。在医药典籍《本草纲目》、《开宝本草》等书中记载魔芋具有抗癌、利尿、解毒消肿、健胃、养发等功效[7]，其性味辛寒。除此之外，因为魔芋具备良好的流变性、凝胶性、水溶性、增稠性、高黏性等，目前已经逐渐应用在食品保鲜、日用化工、工厂工业、医药、等领域，魔芋现在已经成为一种优质的膳食纤维源和功能性原料。魔芋块茎中含有的营养成分主要有葡甘露聚糖、淀粉、纤维、蛋白质，其中主要葡甘露聚糖是效成分，由D-葡萄糖和D-甘露糖通过β-1，4糖苷键合的高分子多糖。葡甘露聚糖由于具有营养价值高，不提供热能的特点，所以其具有调节胆固醇代谢的功能、减肥、便秘、糖尿病、对动脉硬化、胆结石、肥胖症等有显著疗效，被称健康食品。测定魔芋中葡甘聚糖的含量有重要的意义[8]，葡甘露聚糖含量的测定方法主要有3,5-二硝基水杨酸比色法、气相色谱法费林滴定法、苯酚比色法等[9]，其中费林滴定法是经典的国标法，但操作太繁杂；苯酚比色法测定中试剂不稳定，并且苯酚毒性较大；气相色谱法测定需要使用气相色谱仪，导致使用受到限制。而3，5-二硝基水杨酸比色法操作较简便，测定成本低，所以此测定方法是魔芋葡甘露聚糖测定中理想的方法。本论文采用3，5-二硝基水杨酸法测定本土魔芋精粉中葡苷聚糖的含量，为魔芋精粉的品质控制提供依据。

1 实验部分

1.1 试剂和仪器

仪器：800型离心沉淀器(上海手术器械厂)，磁力搅拌器(国华88-1)，恒温水浴锅(江苏金怡仪器科技有限公司)，电子天平(上海良平)，7200可见光分光光度计(上海菁华)，比色皿，250mL容量瓶，25mL容量瓶，10mL容量瓶，试管，玻璃棒，烧杯，移液管。

药品：天津市风船化学试剂科技有限公司生产的氢氧化钠和酒石酸钾钠，3，5-二硝基水杨酸(广东光华科技股份有限公司)，昭通魔芋精粉，甲酸，盐酸，葡萄糖标准品。3，5-二硝基水杨酸(DNS)配制： 用电子天平准确称取3，5-二硝基水杨酸1.0057g，加入20mL 2.0mol/L-1NaOH，在称取酒石酸钾钠30.0989g充分搅拌溶解，用蒸馏水定容至100mL。放置两天，用漏斗过滤，保存在棕色试剂瓶中备用。甲酸-氢氧化钠缓冲液配制：移取1mL甲酸放入烧杯中加入60mL蒸馏水，用电子天平准确称取0.25g氢氧化钠加入烧杯，搅拌溶解倒入250mL容量瓶中加蒸馏水定容至刻度线。1mg/mL葡萄糖标准溶液配制：用电子天平称取分析葡萄糖0.1004g放入烧杯加蒸馏水搅拌溶解，倒入容量瓶，定容至100mL。

1.2 实验方法和结果

1.2.1 葡萄糖标准曲线制作

1.2.1.1 最大吸收波长测定

取葡萄糖标准液用分光光度计在480～550nm之间扫描，葡萄糖标准溶液在490nm处有最大吸收波长，所以确定其最大波长为490nm。

1.2.1.2 葡萄糖标准曲线绘制

用移液管分别准确移取葡萄糖标准溶液0.4,0.6,0.8,1.0,1.2mL分别置于10mL的容量瓶中，加蒸馏水补足3mL。取3mL蒸馏水做空白对照组，在6个容量瓶中分别准确加入1.5 mL 3,5-二硝基水杨酸试剂并摇匀。置于提前加热好的恒温水浴锅中，加热5min。取出至于试管架上冷却至室温，加蒸馏水定容至10mL摇匀。

在490nm处测定吸光度值，以标准葡萄糖浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。线性回归方程为：y=7.31x+0.0666 ，R2=0.9995，如图1所示。

图1 葡萄糖标准曲线

1.2.2 魔芋葡甘聚糖提取液制备、提取和测定

准确称取3份昭通魔芋精粉约0.2g，放入100mL烧杯中并加入50mL甲酸-氢氧化钠缓冲溶液。在磁力搅拌器上匀速搅拌2小时以上，并静置溶胀过夜。倒入100mL容量瓶并用配制好的甲酸-氢氧化钠缓冲溶液定容至刻度线，摇匀。在离心机上以4000 r/min的转速离心20分钟使其溶液分层。上清液就为魔芋精粉中葡苷聚糖提取液。

用移液管准确移取上述魔芋葡甘聚糖提取液5.00mL，加入到25mL容量瓶中。在准确移取3 mol/L的硫酸2.50mL加入，摇匀。放置于恒温水浴锅中加热水解1.5h。用冷却水冷却到室温。加入2.5mL 6mol/L的氢氧化钠溶液摇匀后再加入蒸馏水定容至刻度线。

分别移取上述制得的魔芋精粉葡苷聚糖水解液和蒸馏水(作为空白对照)2.5mL放置于试管中，加入3，5-二硝基水杨酸显色剂(DNS)，在恒温水浴锅中水浴5min。自然冷却后倒入到25mL容量瓶中加蒸馏水定容至刻度线，测定其吸光度。

2 结果分析

2.1 魔芋葡甘聚糖提取条件的优化

2.1.1 水解时间对魔芋葡甘聚糖吸光度的影响

取上述待测液2.5mL，分别水解0.5，1，1.5，2，2.5h 5个梯度下，按上述2.2.2实验方法在最大波长处测其吸光度。实验结果如表1所示。实验结果表明其最佳水解时间在1.5h。

表1 水解时间对魔芋葡甘聚糖提取效果的影响

2.1.2 盐酸加入量对魔芋葡甘聚糖吸光度的影响

取上述待测液2.5mL，选取1，1.5，2，2.5，3mL 5个梯度盐酸加入量，按上述2.2.2方法测吸光度。实验结果如表2所示，实验结果表明盐酸最佳加入量为1mL。

表2 盐酸加入量对魔芋葡甘聚糖提取效果的影响

2.1.3 氢氧化钠加入量对魔芋葡甘聚糖吸光度的影响

分别选取0.5，0.75，1，1.25，1.5mL 5个梯度作为氢氧化钠加入量。按上述2.2.2方法测吸光度。实验结果如表3所示，实验结果表明氢氧化钠最佳加入量为0.5mL。

表3 氢氧化钠加入量对魔芋葡甘聚糖提取效果的影响

2.1.4 共沸时间对魔芋葡甘聚糖吸光度的影响

分别共沸3,5,7,9min和11min 5个梯度下，按上述2.2.2方法测吸光度。实验结果如表4所示，实验结果表明其共沸最佳时间为5min。

表4 共沸时间对魔芋葡甘聚糖提取效果的影响

2.2 稳定性及重复性实验

移取上述2.2.2制备的溶液，每隔30min测其吸光度，连续测定5h考察其稳定性，实验结果表明5h内显色稳定，吸光度无明显变化。

分别称取5份0.2 g的魔芋精粉，按其2.2.2步骤做三组重复性实验进一步确定实验的可行性。实验结果表明RSD为0.0377%，小于5%，该方法重现性较好,该方法可行。

2.4 精密度实验

移取2.5mL水解溶液，用按其2.2.2步骤进行含量测定，重复进样6次，计算RSD值为0.0023%，说明精密度良好。

2.5 回收率实验

准确吸取2.5mL水解试液2份，一份按其2.2.2步骤进行含量测定，一份加入葡萄糖标准使用液0.1mL(相当于0.1mg)，按相同的方法进行溶液的制备，测定吸光度，计算回收率得95.52% 。

2.6 魔芋精粉中葡甘聚糖含量

步骤2.2.2中测定的吸光度值如表5所示，根据线性回归方程式计算出魔芋中葡甘聚糖的浓度。再根据下式葡甘聚糖的含量的计算公式算出魔芋中葡甘聚糖的含量，其中ε为0.9，是葡甘聚糖中葡萄糖和甘露糖残基分子量与其水解后生成的葡萄糖和甘露糖分子量之比[10]，为多糖的校正系数，T样为葡甘聚糖水解液分光光度法测定查标准回归曲线浓度；m为样品的重量。通过计算得知魔芋葡甘聚糖含量为83%。

表5 魔芋葡甘聚糖含量的测定结果

3 结论

本论文采用3，5-二硝基水杨酸法测定魔芋精粉中葡苷聚糖的含量，得知含量在83%。在测定中，魔芋中除魔芋葡苷聚糖外还存在半纤维素、少量游离还原糖及淀粉纤维素等。在剧烈搅拌下魔芋葡甘聚糖可形成稳定的胶体溶液。天然半纤维素和淀粉纤维素由于不溶于水，因此可以通过沉淀离心将半纤维素和淀粉纤维素分离出去，从而达到提高测定的准确性。由于魔芋的膨胀系数很大，导致魔芋精粉中葡甘聚糖颗粒容易吸水而溶胀，使提取多糖的时候试剂用量变大，所以取样的时候要尽量少取一点,一般在1g左右。实验过程中用100mL的缓冲溶液定容后需要放置过夜，离心取上清液液再进行酸水解从而提高效率。本实验采用以盐酸水解方法提取魔芋中葡甘露聚糖,方法简单， 耗费试剂量少，产率高，工艺比较简单