柚子皮黄酮提取与抗氧化性能研究

杨 尉

(浙江大学衢州研究院，浙江 衢州 324000)

黄酮类物质是良好的天然低毒抗氧化剂，不仅对羟基有显著的清理作用，还能够降低血液的黏稠度，减少血栓的形成等，具有极高的药用价值[1]。我国每年的柚子产量几百万吨，而其中柚子皮就约占整个柚子重量的20%～30%，柚子皮往往会被视为垃圾丢弃掉，浪费了隐藏在其中的营养和药用价值资源。柚子皮中含有的丰富黄酮类化合物，通过对柚子皮资源进行合理的开发利用和深加工，能创造较好的经济效益和社会价值[2]。与其他纯化方法相比较，大孔树脂吸附法工艺在富集有效成分、减少杂质、设备便宜、成本较低、使用率较高等方面都显示出其独特性和优越性,使用大孔吸附树脂分离纯化黄酮在中药产品的研发和产业化生产等领域具有十分宽广的前景[3]。

1 实验部分

1.1 实验仪器与试剂

实验仪器见表1。

表1 实验仪器

1.2 实验内容

1.2.1 原料的配制

将市售的柚子果皮剪成细小块状放入烘箱中，在温度为60±1℃的烘箱下烘十八至二十个小时，烘干后将柚子皮取出用粉碎机粉碎成过60目筛，得到柚子皮粉末，密封保存备用[4]。

1.2.2 主要试剂的配制

(1) DNS试剂的配制：按照文献[5]配置，在棕色瓶中存放7天后使用。

( 2)猪油准备：市场现购的新鲜肥猪肉切碎 ，用中火将肥肉熬制到呈金黄色，冷却待用。

(3)硫代硫酸钠标准溶液的配制和标定，按照文献[6]进行。

(4) 芦丁标准液：以芦丁为总酮标准物， 配制芦丁标准液[7]并绘制标准曲线。

1.2.3 柚子皮中黄酮类物质的提取和浓度测定

利用浸提加搅拌提取法，准确称取5.0 g的柚子皮粉末，用70%的乙醇溶液，按20：1在50 ℃恒温提取3h，抽滤得到黄酮类物质的滤液，转移至100 mL的容量瓶中，再用70%的乙醇溶液定容到刻度线，得到黄酮母液(粗提物)待用。采用NaNO2-Al(NO3)3比色法测量黄酮类物质的含量。量取适量的粗黄酮提取液至5 mL的比色管中，以芦丁为总酮标准，设置空白对照。

1.2.4 大孔吸附树脂吸附率和解吸附率的测定方法

准确称取大孔吸附树脂1.00 g于塞口锥形瓶中，加入20 mL黄酮母液，于摇床低速振荡24小时后，收集吸附残夜，并按照公式(1)计算出大孔吸附树脂在室温下(25℃)的吸附率。

吸附率E(%)=(c1-c2)/c1×100

(1)

式(1)中:c1为吸附前黄酮粗溶液浓度/(μg/mL)；c2为吸附后滤液中黄酮浓度/( μg/mL)[25]。

将上述中的吸附饱和树脂，放于50 mL的具塞磨口锥形瓶中，加入20 mL 的70%乙醇溶液，随后放在摇床上振荡解吸附24小时，然后取适量滤液，测定滤液中黄酮的浓度，按公式(2)和(3)计算解吸附量与吸附率：

W/(μg/g)=( c1-c2)×V/m树脂

(2)

解吸率(%)=cV'/W×100

(3)

(2)式中W为黄酮的饱和吸附量/(μg/g)，c1c2分别为吸附前后黄酮浓度/(μg/mL),V为黄酮溶液体积/mL； m树脂为树脂质量(g)。(3)式中：c为解吸液中的黄酮浓度/(μg/mL)； V'为洗脱液体积(mL)。

1.2.5 柚子皮黄酮类物质抗氧化性质研究

取10.00 mL 分离纯化后的黄酮溶液，对照品为70%乙醇溶液。调节pH值为5，并在55 ℃条件下保温一小时后加入20 g的猪油，且置于40℃条件下保温，每隔24小时就测一次猪油的过氧化值(POV)。测定方法采用国标GB5009.5-2003推荐的碘量法。

POV=(V样-V空)*M*100/W油

(4)

式中:POV为过氧化值(meq/kg)；M为Na2S2O3摩尔浓度；V 样为样品用量(mL)； V 空为空白样品用量(mL)；W油为油的质量(g)。

2 实验结果与讨论

2.1 芦丁标准曲线

图1 芦丁标准曲线图

吸光度A与芦丁质量浓度c( μg/mL)的标准曲线和线性回归方程如图1所示：y=0.0144x-0.029，其相关系数R2=0．9998，有良好的线性关系。

2.2 不同树脂的静态吸附性能

表2 不同树脂的性能参数

测定三种大孔吸附树脂对柚子皮黄酮类物质的吸附率和解吸率，其结果如表3所示。

从表3中可以看出三种树脂各项指标都不错，黄酮类化合物因多酚结构和糖苷链使其显弱极性，X-5树脂是非极性树脂对黄酮类化合物的选择性吸附不强，AB-8树脂和DM-301树脂从极性上分析都可以用来吸附黄酮， DM-301树脂的孔径和孔容都优于AB-8树脂，实验证明DM-301比其他两种树脂更适合于柚子皮黄酮类物质的分离纯化[8]。

表3 大孔吸附树脂对柚子皮黄酮类 物质的静态吸附解吸测定结果

2.3 大孔吸附树脂DM-301的静态吸附等温曲线

利用粗提的黄酮原液配置一系列不同浓度的黄酮溶液，分别各准确量取适量溶液加入放有1 g预处理好树脂的磨口锥形瓶中，在室温的条件下静态吸附3h，然后分别移取适量的残夜测量吸光度，并计算出树脂的饱和吸附量。实验结果如图2所示。

图2 孔吸附树脂DM-301的静态吸附等温曲线

整体的趋势是树脂的吸附量随着黄酮溶液浓度的增大而增大，当浓度到达195.14 μg/mL的时候，树脂就基本达到了吸附饱和状态。

2.4 洗脱液及洗脱液洗脱体积分数对大孔吸附树脂的影响

分别用20 mL的30%，50%，70%，99.7%的乙醇溶液进行振摇洗脱，收集洗脱液，测量不同浓度乙醇下的洗脱液吸光度，计算出解析率，结果如图3所示。

图3 乙醇溶液洗脱体积分数对大孔树脂的影响

由图3可以看出，4种体积分数不同的乙醇溶液对大孔树脂的解吸附率不同，这是由于被分离物质与树脂之间的吸附力的强弱不同造成的[29]，根据“相似相溶”的原理，黄酮化合物为弱极性，在4种洗脱体积分数中乙醇浓度越高极性越低，99.7%的乙醇溶液极性最小，因此洗脱效果最佳。

2.5 动态吸附实验

分别准确量10.0，12.0 ，14.0 ，16.0 ，18.0 ，20.0 ，22.0 ，24.0 mL粗提的黄酮类物质置于25 mL的容量瓶中，再以70%的乙醇溶液定容到刻度线。各量取适量配制的黄酮溶液加到装有大孔树脂的层析柱中吸附，然后进行动态吸附，以2 mL/min的流速流出，收集流出液，取适量的流出液测量吸光度，计算出树脂的饱和吸附量，筛选出最佳的动态吸附浓度。

图4 上样浓度对吸附量的影响

由图4可知，当黄酮浓度为214.65 μg/mL时，DM-301树脂的吸附浓度最大，当超过214.65 μg/mL时，其吸附量就开始不再增加反而有下降的趋势，一般来说浓度越高吸附量就越大，但若超过了树脂的吸附极限，即饱和吸附量，则浓度过高就会解析，所以用DM-301大孔吸附树脂分离纯化柚子皮黄酮时黄酮浓度选214.65 μg/mL为最佳。

2.6 柚子皮黄酮类物质的抗氧化性研究

图5 抗氧化稳定性对比

由图5可得，随着时间的延长，油脂被氧化就越明显，且从图5中可知柚子皮黄酮能够改善油脂的氧化，使油脂的耐氧化得到了提高。