刺玫红色素微波辅助提取及其抗氧化性研究

张晨萍，赵志刚，宿 婧，伊文博，赵 悦

(忻州师范学院 生物系，山西 忻州 034000)

现代人对健康食品和食品安全的要求越来越高，天然色素直接取自于自然界中的动物、植物和微生物，不仅具有良好色泽，而且具有一定的营养价值和保健功效，用于食品、化妆品乃至药品安全可靠[1]。刺玫花(Rose rugosa)，蔷薇科蔷薇属植物，多年生常绿或落叶小灌木[2]。刺玫红色素属于水溶性色素，易溶于水、甲醇、乙醇等极性溶剂。有研究表明，品种不同、溶液pH值不同，刺玫红色素的颜色也不同，最大吸收波长也不同，一般在可见光区500～530nm有吸收。刺玫色素属于花色苷色素，具有抗氧化和调节血脂作用，同时具有抑菌作用，对金黄色葡萄球菌、铜铝假单胞菌、白色念珠球菌等菌种作用最为明显[3]。刺玫色素对羊毛和蚕丝织物染色效果较好，可作为蛋白质纤维染色剂[4]。本实验以刺玫花瓣为原料，采用微波辅助提取刺玫红色素，并研究其体外抗氧化性，为刺玫的开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料与试剂

新鲜刺玫，山西忻州，取花瓣于40℃烘干后粉碎；矢车菊-3，5-O-双葡萄糖苷(Cy-3,5-diglu)标准品，国药集团化学试剂有限公司；乙醇：郑州派尼化学试剂厂，分析纯。

1.2 主要仪器

752N紫外可见分光光度计：上海仪电分析仪器有限公司；LC-4016低速离心机：安徽中佳科学仪器有限公司；UV-2800 型紫外可见分光光度计，上海尤尼柯公司；NJLO7-3型实验专用微波炉：南京杰全微波设备有限公司；FA2004N电子天平：上海菁海仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 刺玫红色素最大吸收波长

图1 刺玫红色素吸收光谱

Fig.1 Absorption spectrum of rose rugosa red pigment

准确称取0.5g刺玫花瓣粉末，以50%的乙醇为浸提液，料液比(m/V) l∶10，微波功率400W，40℃下提取5min，过滤离心后取上清液定容至100mL，以50%乙醇溶液作为空白，在200～700 nm波长范围内进行光谱扫描得图1，由图可知最大吸收波长为520.2nm。

1.3.2 绘制标准曲线

根据刺玫红色素的最大吸收波长，选取Cy-3,5-diglu作为参照物，绘制标准曲线[5]。精确称取Cy-3,5-diglu标准品1.00 mg，溶于50%乙醇溶液中，再稀释成5.0、10.0、15.0、20.0、30.0 μg/mL一系列浓度梯度，520 nm处测定各自的吸光度，绘制标准曲线，如图2。

图2 Cy-3,5-diglu 标准曲线Fig.2 Standard curve of Cy-3,5-diglu

其中，X为刺玫红色素得率(mg/g)，C为根据标准曲线计算出的浓度(μg/mL),V为定容体积(mL)，M为原料刺玫花质量(g)。

1.3.3 刺玫红色素的提取方法

1.3.3.1 单因素实验

称取0.5g的刺玫花瓣粉末，选择乙醇体积分数0%、50%、70%、80%、90%、100%，微波功率300W、400W、500W、600W、700W，提取时间2min、3min、4min、5min、6min，液料比1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12，提取所得溶液于4000r/min离心20min，取上清液，定容至100mL，在520nm处测量吸光度[6]，并计算得率。

1.3.3.2 正交试验

根据单因素实验结果，以红色素得率为参考指标，采用正交表L9(34)优化微波法辅助提取刺玫红色素的最佳工艺条件，其因子水平见表 1。

表1 L9(34)正交实验因素水平表Tab.e 1 Factors and levels of L9(34) orthogonal test

1.3.4 刺玫花红色素体外抗氧化性测定

按照上述试验得出的最佳工艺条件提取刺玫红色素，得到的提取液浓缩干燥后用体积分数 50 %的乙醇溶液配制为10 mg/mL、20 mg/mL、30mg/mL、40 mg/mL、50mg/mL质量浓度的刺玫花红色素溶液，并配制同浓度的Vc作对照[7]。

1.3.4.1 总还原力测定

采用铁离子还原力测定法[8]，取5支试管分别加入不同浓度的样品溶液1 mL，加入3.0 mL pH值为6.8的磷酸盐缓冲液和2.5 mL1%的铁氰化钾溶液，45℃水浴30 min后放在室温下自然冷却后加入3.0 mL 10%的三氯乙酸溶液，震荡混合后离心(6000 r/min，20 min)。取上清液3 mL加入2 mL蒸馏水和1 mL0.1%三氯化铁溶液振荡摇匀，在700 nm处测吸光度值，以同浓度的Vc作对照。

1.3.4.2 刺玫花红色素清除羟基自由基(·OH)能力的测定

采用水杨酸法[9]，取5支试管分别加入不同浓度的样品溶液1 mL，向其加入浓度为6 mmol/L的亚硫酸铁溶液1 mL，再加入相同浓度的双氧水1 mL，振荡摇匀后放置10 min，再加入1 mL6 mmol/L的水杨酸溶液，振荡摇匀放置30 min，在510 nm处测吸光度值，以同浓度的Vc作阳性对照。

其中：A0——不加样品的吸光度值；Ai——加入样品的吸光度值；Aj——不加入水杨酸的吸光度值。

1.3.4.3 刺玫花红色素清除超氧阴离子自由基(O2-·H)能力的测定

采用邻苯三酚自氧化法[10]，取5支试管分别加入不同浓度的样品溶液1 mL，加入pH为8.2的Tris-HCl缓冲液6 mL，振荡摇匀置于37℃水浴锅中水浴10 min，加入37℃邻苯三酚盐酸溶液1 mL，振荡摇匀静置4 min后用1 mL浓盐酸终止反应，在波长325 nm处测定吸光度值。以同浓度的Vc作阳性对照。

其中：A0——不加样品测定的吸光度值；A——加入样品测定的吸光度值。

2 结果与分析

2.1 微波法辅助提取刺玫红色素工艺条件优化

2.1.1 单因素实验

从图2(a)可以看出，红色素得率伴随着乙醇体积分数增加而逐步降低，乙醇体积分数为50%时，红色素得率较高。从经济方面考虑，50%乙醇作为溶剂也较为合适。

从图2(b)可以看出，微波法功率在300～500W之间，红色素得率伴随着微波功率增加而增加，在微波法功率达到500W的时候，红色素得率达到了最大值，但是之后随着微波功率增加得率降低，这可能是因为微波法有很强的热效应，功率过大可能会使色素受到一定的破坏，引起得率降低[11]。

从图2(c)可以看出，微波时间达到3min时，色素得率达到了最大值，之后伴随着微波时间的逐步增加色素得率降低，提取时间过长，色素长期处于较高温度下，结构会被破坏，得率降低[12]。由此可知微波法提取刺玫红色素时间不应过长。

从图2(d)可以看出，温度在25-50℃之间，色素得率伴随着温度的增加逐步增加，温度大于50℃时，色素得率降低。

从图2(e)可以看出，液料比在1∶4～1∶8之间，色素得率伴随着液料比的变化逐步增加，液料比为1∶8～1∶12时，伴随着液料比的变化色素得率降低。

图3 单因素实验

Fig.3 Single factor experiment

2.1.2 正交试验分析

根据单因素试验结果与分析，对提取刺玫红色素的微波功率、提取时间、提取温度、料液比进行了L9(34)试验，其结果如表2。由正交试验可以看出各因素对刺玫红色素得率的影响顺序为C>B>A>D，即提取温度>微波时间>微波功率>料液比。由正交试验可得到刺玫红色素最佳提取的优化工艺参数为：A2B1C3D3，即在微波功率500W，微波时间2min，提取温度60℃，料液比为1∶10 g/m L。对所得出的正交表进行验证试验，用最佳优化的条件进行三次重复试验，刺玫红色素得率接近2.03mg/g，结果重现性好。

表2 正交实验结果Tab.e 2 Result of orthogonal experiment

表2(续)

2.2 刺玫红色素体外抗氧化活性测定结果

2.2.1 总还原力测定结果

分析图4可以得出，刺玫红色素溶液的还原力与Vc溶液的还原力都随着溶液浓度的增加而增加，说明刺玫红色素具有一定的抗氧化活性，且与浓度成正比。

图4 刺玫红色素还原力Fig.4 Reducing force of rose rugosa red pigment

2.2.2 刺玫红色素对羟基自由基(·OH)清除率的测定

体系发生化学反应使得在510 nm处测定的吸光度值变小，根据测得的吸光度值可以计算出刺玫红色素对羟基自由基(·OH)的清除能力。分析图5可以得出，随着刺玫红色素溶液浓度的增加，其吸光度值降低，对羟基自由基的清除率增加，说明刺玫红色素羟基自由基(·OH)有一定的清除能力，并与浓度呈正比。

图5 刺玫红色素对羟基自由基(·OH)清除率Fig.5 Red pigment ability to remove hydroxyl radicals(·OH)

2.2.3 刺玫红色素对超氧阴离子(O2-·)清除能力测定结果

在碱性条件下邻苯三酚发生氧化反应，产生有色的产物和超氧阴离子自由基(O2-·H)；超氧阴离子自由基(O2-·H)对此氧化反应有催化作用，加速反应的进行。随着反应的进行，有色中间产物产生的越多，颜色越深，在325nm处测得的吸光度值越大[13]，其对羟基自由基的清除率越大，根据测得的吸光度值可以判断刺玫红色素对超氧阴离子(O2-·H)的清除能力。分析图6可以得出，刺玫红色素提取液对超氧阴离子自由基(O2-·H)具有较好的清除能力。

图6 刺玫红色素对超氧阴离子自由基清除率Fig.6 Red pigment ability superoxide anion radicals(O2-·H)

3 结论

本研究采用正交试验对工艺条件进行优化，最后根据刺玫红色素得率，得出微波提取的最优方案是乙醇浓度50%，微波功率500W，微波时间2min，提取温度60℃，料液比为1∶10 g/m L，此时花色素得率为2.03mg/g。与传统水浴提取法和超声波提取法对比微波提取法大大地提高了色素得率，同时缩短了提取时间。此实验证明了微波法提取刺玫红色素的可行性。通过对刺玫红色素的体外抗氧化性的测定结果可以看出，刺玫红色素具有一定的体外抗氧化性，且随着刺玫红色素溶液浓度的增大，还原力增加，其对羟基自由基(·OH)的清除能力增加，对超氧阴离子自由基(O2-·H)的清除能力也在增加。