香薷乙醇提取物对禽传染性支气管炎病毒增殖的影响

(长江大学动物科学学院，湖北 荆州 434025) (长江大学农学院，湖北 荆州 434025)

由禽传染性支气管炎病毒(Avianinfectiousbronchitisvirus,IBV)引起的禽传染性支气管炎(Avianinfectiousbronchitis,IB)是一种高接触性、急性的呼吸道传染病,可导致不同日龄的鸡发生不同程度的疾病[1]。IBV基因组RNA转录的不连续性以及RNA酶的不完全校对机制，使该病毒易于发生基因突变，导致该病毒的基因型、血清型复杂，各血清型之间仅有部分或者完全没有交叉保护的作用[2]。因此，给该病的防控带来了很大的困难，同时会造成养鸡产业重大经济损失[3]。中药方剂是目前治疗IB的重要手段之一。刘振湘[4]、刘鹏飞[5]、王海花等[6]应用中药方剂治疗鸡传染性支气管炎，结果表明所使用的复方中草药对于禽传染性支气管炎的治疗有一定的作用。下面，笔者初步探讨了香薷(Elsholtzia ciliata (Thunb.)Hyland.)的体外抗病毒方式，以期为抗IBV的中草药开发和研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验药物的准备

香薷购自湖北省荆州市第一人民医院中药房。将购来的香薷磨成粉末状称重，用一定体积的80%乙醇静置浸泡7d以上，再用0.22μm直径过滤器过滤除菌，样品4℃保存备用。

1.1.2 供试病毒及细胞

试验所用病毒为IBV-3ab-luc，是利用反向遗传学技术在IBV的全基因组序列上采用荧光素酶luciferase的基因序列替代IBV的非功能基因3ab片段，使其能够成功侵染人类细胞系(H1299)，且其致病力和遗传稳定性均与IBV相近。该病毒能够在感染细胞后，在其增殖过程中融合表达荧光素酶。

H1299细胞(人肺癌细胞系)由新加坡南洋理工大学生物学院病毒实验室赠予。

1.1.3 仪器与试剂

主要试剂：二甲基亚砜(DMSO，天津市天力化学试剂有限公司)、MTT(4,5-二甲基噻唑-2,5二苯基四唑溴化物，北京索莱宝科技有限公司)、TRIZOL(赛默飞世尔科技有限公司)。

主要仪器：荧光检测器(Promega公司)、PCR仪(BIO-RAD公司)、细胞培养箱(SAN-YONG公司)。

1.1.4 PCR扩增及引物序列

试验过程中应用的检测细胞因子表达量引物如表1所示。

表1 RT-PCR引物序列

1.2 试验方法

1.2.1 香薷乙醇提取物作用于H1299细胞的最大无毒浓度的测定

将所制得的香薷乙醇提取物用80%乙醇作溶剂进行倍比稀释，得到5个浓度梯度，分别为0.3、0.15、0.075、0.0375、0.01875g/mL。在12孔板中用DMEM培养基培养H1299细胞，当细胞覆盖达到80%左右时，每孔加入稀释好的香薷乙醇提取物6μL，每个浓度3个重复，同时设置空白对照，放入细胞培养箱培养。培养24h后，去掉上清，重新加入不含FBS的DMEM培养基1mL，每孔200μL培养基加入20μL MTT，浓度为5mg/mL，放入培养箱中培养。培养4h后，吸出上清液，每孔加入500μL DMSO，待形成的甲臜(Formazan)充分溶解于DMSO后，用酶标仪在550nm波长处测出每孔光密度值。

1.2.2 不同处理方式下香薷乙醇提取物对IBV增殖的影响试验

病毒感染采用3种方式进行处理。

方式1：在12孔板中培养H1299细胞，待H1299细胞达到80%左右时，再加入实验测得的最大无毒浓度的香薷乙醇提取物6μL，然后放入培养箱中培养。培养24h后去掉每孔上清，重新加入不含FBS的DMEM培养液1mL，再加入IBV-3ab-luc 100μL感染。感染24h后按照文献[7]的方法检测荧光值。

方式2：在12孔板中培养H1299细胞，待细胞覆盖度达到100%时，去掉上清，加入不含FBS的DMEM培养液1mL，加入100μL IBV-3ab-luc感染细胞，感染16h后，加入最大无毒浓度的香薷乙醇提取物6μL，再进行培养。培养24h后按照文献[7]的方法检测荧光值。

方式3：在12孔板中培养H1299细胞，待细胞覆盖度达到95%以上时，去掉上清，加入不含FBS的DMEM培养液1mL，在EP管中将100μL IBV-3ab-luc与6μL香薷乙醇提取物在室温环境中充分混合，再进行感染。感染24h后按照文献[7]的方法检测荧光值。

每种方式3次重复，同时设置对照组。

将对照组的荧光值与各处理的荧光值的比值(N)的数量级数lgN作为抑制效力参考指标，N值越大表明抑制效力越强[8]。

1)不同浓度的香薷乙醇提取物对IBV增殖的影响 将香薷乙醇提取物用80%乙醇梯度稀释为0.3、0.15、0.075、0.0375、0.01875g/mL 5个不同的浓度，采用上述方式3进行处理，每组3个重复，感染24h后按文献[7]的方法检测荧光值。

2)不同培养时间下香薷乙醇提取物对IBV增殖的影响 在12孔板中培养H1299细胞，待细胞长满后采用上述方式3进行处理，加入100μL IBV-3ab-luc和6μL 香薷乙醇提取物混合物，做3个重复，设置时间梯度，分别培养4、8、12、16、24h后去除上清，取适量PBS清洗每孔，再加入100μL RLB用枪头充分刮下细胞后冻融一次并检测不同培养时间下的荧光值，以反映病毒的增殖情况。每组梯度设置对照，培养不同时间后检测荧光值。

1.2.3 香薷乙醇提取物对感染IBV的细胞内抗病毒基因表达量的影响试验

在6孔板中培养H1299细胞，待细胞长满后，去除上清，加入不含FBS的DMEM培养液2mL，再接入200μL IBV-3ab-luc，37℃培养24h，作为对照。另外一个6孔板上培养H1299细胞，待细胞覆盖达到95%以上时，去除上清，加入不含FBS的DMEM培养液2mL，采用上述方式3进行处理，在EP管中将100μL IBV-3ab-luc与6μL香薷乙醇提取物在室温环境中充分混合，再接入200μL IBV-3ab-luc进行感染，在37℃培养箱中培养24h。按照文献[9]的方法提取总RNA后进行RT-PCR，将PCR产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳并检测扩增结果。

2 结果与分析

2.1 香薷乙醇提取物作用于H1299细胞的最大无毒浓度的确定

注：CK为未加药的空白对照; ns表示与对照组比较P>0.05，** 表示P<0.01。 图1 不同浓度香薷乙醇提取物处理细胞后的光密度

图1结果表明，当提取物浓度为0.01875、0.0375、0.075、0.15g/mL时，其光密度与对照组相比较差异不显著(P>0.05)，表明各浓度提取物对细胞生长无抑制作用。当提取物浓度为0.3g/mL其光密度值小于其他提取物浓度的光密度值，且差异显著(P<0.05)，表明该浓度提取物对细胞的生长存在抑制作用，因此将提取物浓度0.3g/mL确定为香薷乙醇提取物作用于H1299细胞的最大无毒浓度。

2.2 不同处理方式下香薷乙醇提取物对IBV增殖的影响

表2结果表明，3种病毒感染方式下香薷乙醇提取物对病毒增殖都有不同程度的抑制效果。方式1和方式2对病毒增殖有抑制效果，方式3对病毒增殖的抑制效果最显著。

表2 香薷乙醇提取物不同处理方式下IBV-3ab-luc增殖量的荧光值

注：比值(N)为对照组的荧光值与各处理的荧光值的比值。

2.2.1 不同浓度香薷乙醇提取物对IBV增殖的影响

图2结果表明，采用方式3处理，当香薰提取物浓度为0.3、0.15、0.075、0.0375、0.01875g/mL时，这5种浓度的药物对细胞的生长均有显著抑制作用。药物浓度越高，检测到的荧光值越低，说明药物对病毒的增殖的抑制作用越明显；反之，检测到的荧光值越高，说明药物对病毒的增殖的抑制作用越不明显。因此，香薷乙醇提取物抑制IBV增殖的效果与其浓度成正相关关系。

2.2.2 不同培养时间下香薷乙醇提取物对IBV增殖的影响

图3结果表明，采用香薷乙醇提取物与病毒混合感作处理，随着培养时间的延长，药物对IBV增殖的抑制效果越显著，说明香薷乙醇提取物对IBV增殖的抑制作用与作用时间呈正相关关系。

注：CK为未加药的空白对照;*** 表示与 注: CK为未加药的空白对照,0.3g/mL代表加药浓度为 对照组比较,P<0.001。 0.3g/mL。*** 表示与对照组比较， P<0.001。 图2 不同浓度香薷乙醇提取物处理病毒 图3 不同培养时间下香薷乙醇提取物处理病毒 感染细胞后IBV-3ab-luc的荧光值 感染细胞后IBV-3ab-luc的荧光值

2.3 香薷乙醇提取物对感染IBV的细胞内抗病毒基因表达量的影响

由图4和图5可以看出，在病毒感染方式3下，香薷乙醇提取物能够促进感染IBV细胞抗病毒基因的表达，从而抑制IBV在细胞内的增殖。

注： 2、5分别为IBV侵染细胞后SOCS3、STAT1的表达；3、6分别为用香薷乙醇提取物处理病毒感染的细胞后，细胞内抗病毒基因SOCS3、STAT1的表达；1、4为阳性对照。图4 不同处理下的H1299细胞中SOCS3、STAT1的表达

3 讨论

传统疫苗的广泛使用并未使IB得到有效控制，主要原因是不同基因型或血清型毒株的存在和新变异毒株的不断出现，而现有的疫苗大多只对同型毒株提供有效的交叉保护而对异型毒株的保护效果差，甚至完全无效。使用化学合成的抗病毒药物防治IB，在抑制或杀灭病毒时，往往给宿主细胞造成一定程度的损伤，同时还存在易产生耐药性和发生药物残留等缺点。现代医学证实，许多中草药不仅具有抑制、消除炎症的功效，还能有效修复受损组织，发挥镇痛、解毒之功效，同时有助于机体增强抗应激能力，促进肾上腺皮质活动，强化脑垂体功能，因而可利用中草药来防治鸡传染性支气管炎[10]。我国有着丰富的植物资源，药用植物种类丰富，而现代药理学研究表明，植物中含有丰富的抗病毒成分，是抗病毒研究的好材料。

注： 2、5分别为IBV侵染细胞后IFN-β、OASL的表达；3、6分别为用香薷乙醇提取物处理病毒感染的细胞后，细胞内抗病毒基因IFN-β、OASL的表达；1、4为阳性对照。 图5 不同处理下的H1299细胞中IFN-β、OASL的表达

香薷是一种应用较多的中药，属唇形科香薷属的一年生草本植物。其性温、味辛，具有解热、消炎、解痉、镇痛、增强免疫等优良作用[11]。从香薷中提取鉴定的包括挥发油在内的成分，总共达到了100多种，其中主要的化合物成分是黄酮和香豆素[12]。黄酮类化合物具有抗菌抗炎、抗病毒、抗氧化、抗癌以及增强免疫力的作用[13]。应国红等[14，15]，以乙型肝炎病毒(HBV)为对象，研究发现香薷水提取物对其有明显的抑制作用，后来通过应用酶联免疫吸附试验(ELISA)的方法，又发现其对乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)也有明显的抑制作用。本研究发现香薷乙醇提取物的3种处理方式均能对IBV在细胞内的增殖起到一定的抑制作用，以香薷乙醇提取物与病毒混合感作后加入对IBV的抑制效果最明显。浓度梯度试验结果表明，香薷乙醇提取物对IBV的抑制效果与其浓度成正比，浓度越高，对抑制IBV增殖的效果越明显。时间梯度试验结果表明，药物对IBV增殖的抑制效果有一定的时间依赖性，随之药物处理时间的增加，对IBV的抑制效果越明显。

IBV感染细胞后会诱导产生抗体，同时也会激活细胞毒T细胞介导的细胞免疫应答，IBV也可通过调控多条信号通道促进病毒的复制，从而引起免疫逃避作用[16,17]。为了进一步了解香薷抗IBV的作用机制，本研究通过RT-PCR的方法，检测了香薷乙醇提取物处理IBV感染的细胞后3种抗病毒基因SOCS3、OASL、STAT1的表达量，与对照组相比，使用香薷乙醇提取物处理感染IBV的细胞后，细胞内抗病毒基因SOCS3、OASL、STAT1的表达量均有提升。SOCS3、OASL、STAT1为干扰素信号转导过程中重要的细胞因子。干扰素是一类糖蛋白，它具有高度的种属特异性，具有抗病毒、调节免疫及抗肿瘤作用，在宿主抗病毒应答中具有重要作用，它能够激活细胞中多种信号传导途径，从而发挥各种生物学功能，其中JAK-STAT途径为抗病毒过程中最主要的途径，它还可通过调节宿主获得性免疫功能，间接清除病毒[18]。本研究结果说明香薷乙醇提取物可以通过调控干扰素途径，增强抗病毒免疫反应，从而抑制病毒的增殖。香薷的成分比较复杂，且不同的有效成分会作用于不同的靶点和不同的环节从而产生多种药理作用，但香薷对IBV的抑制作用是其中具体哪一种或哪几种有效成分发挥抗病毒作用以及如何发挥抗病毒作用，还有待进一步研究。