基于焦磷酸测序研究雪豹肠道微生物多样性

刘 咪 朱 静 陈佳欣 丁慧霞 高 迎姜文君 袁 坤 董 欣 陈 磊*

(1.曲阜师范大学生命科学学院，曲阜，273165；2.济南野生动物园，章丘，250200)

雪豹(Pantherauncia)是青藏高原及中亚山地生态系统的旗舰物种，通常分布在海拔3 000 m以上的区域，是雪豹属的唯一代表。由于食物缺乏、栖息地退化和人为干扰，雪豹的种群数量持续下降。由于野生雪豹行踪诡秘，种群监测困难，现有研究数据较少。已有学者围绕雪豹的行为[1]、食性[2]、栖息地[3]和种群恢复等领域展开研究[4]，另有少数关于雪豹繁殖生理学[5]和分子生态学领域的研究报道[6-7]。

肠道微生物是宿主食物消化和肠道免疫中不可或缺的部分[8]，在为宿主提供营养物质的同时，可以激活宿主肠道免疫系统，帮助宿主抵抗病原体的侵袭[9]。食肉动物的食物中通常含有大量的动物组织，为肠道微生物提供了可用于发酵的底物[10-11]。在某些功能菌群的帮助下，一些难以消化的食物可以转化为挥发性物质[12]。因此，探讨食肉动物肠道微生物多样性可以更好地分析肠道微生物在食肉动物的食物资源利用中的功能贡献。猫科(Felidae)动物是典型的食肉动物，Ritchie等较为系统地描述了家猫的肠道微生物多样性特征[13-15]，但是对野生猫科动物肠道微生物的研究较少[16-21]。Zhang等和刘广帅通过利用第一代测序技术初步研究了雪豹粪便微生物群落的组成和多样性特征[22-23]。随着高通量测序技术的发展，大批量测序数据的产出为深入、完整地了解雪豹肠道微生物的多样性奠定了基础[24]。已有学者借助高通量测序技术对猎豹(Acinonyxjubatus)、东北虎(Pantheratigrisaltaica)、金钱豹(Pantherapardus)等野生猫科动物的肠道微生物多样性进行了研究[25-28]，然而，关于雪豹肠道微生物高通量测序的研究尚未见报道。

本文首次利用高通量测序技术对雪豹肠道微生物多样性进行研究，为分析雪豹的消化生理和能量摄取机制提供基础数据，为雪豹的保护和饲养管理提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 样本收集

粪便样本于2014年冬季采集自青海省西宁动物园4只半散放饲养的健康成年雪豹，其中雄性3只，分别命名为样本5、6和7；雌性1只，命名为样本8。雪豹年龄4—8岁，体重50—60 kg，食物以新鲜牛羊肉为主，偶尔添加活兔。所有实验动物在样本采集前的3个月内均未使用抗生素或益生菌治疗。在动物自然排便后的30 min内，用无菌取样袋采集新鲜粪便样本，将每个个体的粪便标记为不同的样本，用干冰运回实验室，置于-80℃冷冻保存。

1.2 DNA提取与16S rRNA基因扩增

使用QIAamp®DNA Stool Mini Kit试剂盒(Qiagen，Germany)对粪便样本(100 mg/样本)的基因组DNA进行提取，使用通用引物27F(5′-AGAGTTGATCCTGGCTCAG-3′)和533R(5′-TTACCGCGGCTGCTGCAC-3′)扩增细菌16S rRNA基因V3-V4区。PCR反应体系为30 μL，包括PCR反应缓冲液15 μL，双端引物各1.5 μL，模板DNA 10 μL，ddH2O 2 μL。PCR步骤包括：94℃预变性4 min；(94℃变性10 s，55℃退火10 s，72℃延伸15 s)，35个循环；最后延伸72℃，10 min。使用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，使用凝胶提取试剂盒(Axygen，China)纯化PCR产物，使用Agilent 2100生物分析仪(Agilent，USA)进行质量控制，根据罗氏生命科学公司对DNA浓度和PCR技术的要求，以等摩尔比的方式合成扩增文库，使用Roche A sequencing primer kit试剂盒(Roche，Swiss Confederation)借助Roche GS FLX高通量测序平台进行焦磷酸测序。

1.3 数据分析

参照标签序列将下机数据分配到样本中去。选择碱基数在300—600 bp的序列用于后续分析。应用Qiime软件(Version 1.9.1)进行质控，并删除嵌合体序列，获得有效序列[29-31]。应用UPARSE 软件(Version 7.0.1001)将有效序列进行聚类，依据97%的序列相似性划分OTU[32]。从每个OTU里面选择一个丰度最高的序列作为该OTU的代表序列，应用Mothur软件包(Version 1.35.1)与 SILVA’s SSUrRNA 数据库(设置threshold=0.8—1.0)比对，进行物种注释[33]，获取各分类阶元(门、纲、目、科、属)的物种信息，计算α多样性指数，包括Observed-species，Chao1，Shannon，Simpson，Ace，Goods-coverage。依据OTU信息绘制各分类阶元柱状图；依据α多样性指数进行β多样性分析，绘制花瓣图和热图。

2 结果

经过质控和去除嵌合体序列后，共得到83 512条有效序列，序列的平均长度为351 bp。基于97%的序列相似性，从样本5、6、7和8中分别获得98、114、104和136个OTU。基于OTU的Goods coverage，Chao 1，Ace，Shannon-Weiner和Simpson指数见表1。

表1 雪豹肠道微生物物种丰度和α多样性指数

Tab.1 Species abundance and α diversity of snow leopard fecal microbial communities

2.1 分类组成

在雪豹粪便样本中共发现9个细菌门，18纲，31目，64科，82属。其中丰度最高的5个细菌门分别为：厚壁菌门(Firmicutes，26.58%—46.59%)、放线菌门(Actinobacteria，29.21%—45.96%)、拟杆菌门(Bacteroidetes，1.61%—16.26%)、梭杆菌门(Fusobacteria，2.03%— 24.78%)和变形菌门(Proteobacteria，3.10%—5.79%)，它们占雪豹粪便微生物OTU总数的99.7%以上(图1)。在门的水平上，雪豹粪便微生物组成存在一定差别：样本5的拟杆菌门丰度(16.23%)高于样本6(8.13%)、样本7(4.09%)和样本8(1.61%)，但放线菌门的丰度(29.21%)低于样本6(45.96%)、样本7(40.38%)和样本8(43.71%)。样本7中厚壁菌门(26.59%)丰度低于样本5(46.59%)、样本6(37.50%)和样本8(43.72%)，但是梭杆菌门(24.78%)丰度比样本5(2.03%)、样本6(5.24%)和样本8(6.79%)要高。

放线菌门放线菌纲(Actinobacteria)的红蝽菌目(Coriobacteriales)占OTU总数的40.38%—45.96%，是雪豹粪便样本中最丰富的类群(样本5除外)。在样本5中，超过50%的序列被归类到梭菌纲(Clostridia)(55.42%)并且主要为梭菌目(Clostridiales)。除此之外，还有其他4个纲的丰度较高，分别是梭杆菌纲(Fusobacteria)、拟杆菌纲(Bacteroidia)、变形菌纲(Betaproteobacteria)和丹毒丝菌纲(Erysipelotric)，这6个纲的比例占OTU总数的90%以上(91.54%—98.57%)(图2)。

大多数序列可以在科水平上分类(图3)。然而，还存在部分未分类序列，它们分别占样本5、6、7、8的OTU总数的0.79%、0.95%、0.20%和2.22%。红蝽杆菌科(Coriobacteriaceae)是雪豹粪便样本中丰度最高的科，除样本5(占比29.2%)之外，在其他3个样本中均占OTU总数的40%以上。其他丰度较高的科包括毛螺菌科(Lachnospiraceae)、梭杆菌科(Fusobacteriaceae)、梭菌科(Clostridaceae)、拟杆菌科(Bacteroidaceae)、消化链球菌科(PeptoStreptococcusaceae)、丹毒丝菌科(Erysipelotrichaceae)。这些科所包含的OTU在每个样本中均占OTU总数的90%以上。

在属的水平上，柯林斯氏菌属(Collinsella)是雪豹粪便样本中丰度最高的属，其次是狭义梭菌属(Clostridiumsensustricto)、梭菌属(ClostridiumXI)、拟杆菌属(Bacteroides)、球菌-直肠真杆菌属(Blautia)和丹毒丝菌属(Erysipelotrichaceaeincertaesedis)等。在样本5中只有2条序列被归类为梭杆菌属(Fusobacterium)，并且没有序列被归类到巨单胞菌属(Megamonas)，而在其他样本中至少1%的序列被归类到这些属。在样本5、6、7中，约1%—5%的序列被分类为萨特氏菌属(Sutterella)，而在样本8中没有序列被归类到该属。在属的水平上，未分类的序列所占的百分比为14.88%(样本7)—24.31%(样本5)(图4)。

图1 雪豹肠道微生物门水平相对丰度Fig.1 The relative abundance of total sequences of bacterial 16S rRNA genes from snow leopard fecal samples at the phylum level

图2 雪豹肠道微生物纲水平相对丰度Fig.2 The relative abundance of total sequences of bacterial 16S rRNA genes from snow leopard fecal samples at the class level

图3 雪豹肠道微生物科水平相对丰度Fig.3 The relative abundance of total sequences of bacterial 16S rRNA genes from snow leopard fecal samples at the family level

图4 雪豹肠道微生物属水平相对丰度Fig.4 The relative abundance of total sequences of bacterial 16S rRNA genes from snow leopard fecal samples at the genus level

2.2 多样性分析

为比较样本间微生物群落的差异，基于各样本的OTU丰度和thetayc系数绘制热图，结果表明，样本6和样本7之间相似程度最高，然后是样本5和样本6。样本8与其他3个样本差异较大(图5)。

通过基于各样本属的丰度绘制热图，分支树的拓扑结构显示样本5、6和7聚集在一起，样本8为单独一支(图6)。

图5 基于各样本OTU丰度和thetayc系数绘制的热图Fig.5 Heatmap of the jaccard and thetayc coefficients 注：颜色表示4个样本肠道微生物OTU的丰度，其中黑色(值=0.0)代表最低，红色(值=1)代表丰度最高。用邻接法计算系统发育树，用完全聚类法确定样品间的关系 Note：The outlying mark number was the fourth sample.The color code represents the similarly of the four sample gut microbe communities，where black(value=0.0)represents the lowest and red(value=1)the highest level of abundance.Dendrogram showed the bacterial distribution among the four samples.The bacterial phylogenetic tree was calculated using the neighbor-joining method，and the relationship among samples was determined by thetayc distance and the complete clustering method

图6 不同样本属水平丰度热图Fig.6 The heatmap plot depicts the abundance of each colon library at genus level 注：属的相对丰度通过颜色强度来展示，采用完整聚类方法和thetayc系数确定样品间的关系 Note：(variables clustering on the Y-axis)within each sample(X-axis clustering).The relative values for bacterial genus are depicted by color intensity with the legend indicated at the top of the figure.Clusters using the neighbor-joining method based on the distance of the four samples along the X-axis and the bacterial genera along the Y-axis are indicated in the upper part and left of the figure，respectively.The relationship among samples was determined by thetayc coefficients and the complete clustering method

基于样本的OTU丰度构建了维恩图以比较不同样本的相似性(图7)。在319个OTU中，所有样本共有OTU为19，分别包括样本5、6、7和8的文库的19.39%、16.67%、18.27%和13.97%。样本5和6、样本5和7、样本5和8、样本6和7、样本6和8以及样本7和8之间的OTU共享数分别为28、31、30、37、43和42。

图7 基于样本OTU丰度构建的韦恩图Fig.7 Venn diagram at distance 0.03 constructed to compare the similarity of different samples based on OTUs

3 讨论

肠道微生物在食肉动物的食物消化、健康和免疫中发挥着重要作用。研究者基于传统的一代测序技术通过16S rRNA基因测序报道了雪豹粪便微生物群落中包括4个细菌门：放线菌门、厚壁菌门、拟杆菌门和变形菌门[6]。在本研究中，我们使用高通量454焦磷酸测序技术研究了圈养雪豹的主要肠道微生物群，检测到9个细菌门，其中5个核心菌门分别是：放线菌门、厚壁菌门、拟杆菌门、梭杆菌门和变形菌门。

据报道，厚壁菌门和拟杆菌门在成年人的肠道和粪便微生物群中占主导地位，它们占OTU总数的90%以上[34-35]。在人类和其他哺乳动物的消化道微生物群落中，放线菌门通常只占很小的一部分[35-38]。然而，在本研究中，我们发现在雪豹粪便样本中放线菌门的丰度与厚壁菌门相似。在样本6和样本7中，放线菌门的丰度(40.38%—45.96%)甚至超过厚壁菌门(26.58%—37.50%)。这一结果与Zhang对雪豹肠道微生物的研究结果一致[22]。只有少数研究报道了放线菌门是哺乳动物肠道微生物的主要菌门。一项使用454焦磷酸测序对人类肠道微生物群落进行研究的文章表明，放线菌门是人类和猫肠道中丰度前二位的门[39-40]。另一项研究讨论了成年猫营养物质摄取与粪便微生物群之间的关系，发现补充低聚果糖可以使猫粪便中放线菌门中的双歧杆菌增加[41]。另有报道推断，由于放线菌门的细菌G+C含量较高，使用通用细菌引物和PCR方案的应用可能导致放线菌门的检测出现偏差[42]。分类群特异性PCR方法显示，包括家猫在内的成年哺乳动物中放线菌门的含量相对丰富[43]。此外，有研究认为，基于CPN60的方法能够较好地检测放线菌门的细菌[40，44]。

拟杆菌门是家猫等哺乳动物远端肠道和粪便微生物群中的另一个重要的门[38，45-46]。研究表明，拟杆菌门的丰度在种间和种内水平上存在很大差异[15，39，47]。另一项关于家猫消化道的报告中，属于拟杆菌门的细菌仅占约10%[13]。本文我们通过高通量测序，在雪豹的粪便样本中检测到的较低丰度的拟杆菌门，这与基于一代测序对雪豹肠道微生物的研究结果一致[22-23]。

总之，本数据首次采用高通量焦磷酸测序技术研究雪豹粪便微生物，发现了雪豹粪便微生物的独特特征，特别是高丰度的放线菌门。这一结果将有助于进一步开展雪豹的消化生理学研究，从而为雪豹的救护饲养提供数据基础。从雪豹粪便样本中共检测到的319个OTU中，Venn图显示只有大约19个OTU是4个样本共有的，表明雪豹肠道微生物存在较大的个体差异。尽管我们尽力通过改进方法来减少实验误差，但由于16S rRNA基因序列的数据库是有限的，所以仍有一定比例的OTU无法进行有效分类。与此同时，本研究中使用的样本来自圈养雪豹，其食物和栖息地环境与野生雪豹不同。因此，在下一步研究中，需要进一步补充野生样本，增加样本量并尝试更多的高通量测序方法，以更深入地了解雪豹的肠道微生物群落特点，为雪豹营养生态学研究和保护服务。