自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤对荜茇酰胺抗肿瘤作用的影响

叶 武 黄勍栋 唐婷玉 叶 芃 杜坚宗

肺癌是危害人类生命和健康的主要恶性肿瘤之一。荜茇属于胡椒科植物荜茇的干燥未成熟或成熟的果穗[1]。荜茇酰胺是一种中药单体，存在于荜茇根，以及瘤突胡椒和长柄胡椒根[2]。近年研究发现，荜茇酰胺具有抗肿瘤、抗炎、抗血小板凝集、镇痛、镇静、抗真菌、抗血吸虫、抗焦虑以及抗抑郁等多种药理作用[3]。本研究旨在探讨荜茇酰胺对肺癌的抗肿瘤作用。

1 实验材料

1.1 药 品 荜茇酰胺（批号S7551）购于美国Selleck chemicals 公司；2'、7'-二氯-荧光素二乙酸酯（DCFH-DA，批号S0033）购于上海碧云天生物技术研究所；N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC，批号S0077）购于上海碧云天生物技术研究所；3-甲基腺嘌呤（批号S9281）购于美国Selleck chemicals 公司。

1.2 试剂及仪器 CCK-8 溶液（批号C008-3）购于上海七海复泰生物科技有限公司；α-tubulin（批号T5168）购于美国Sigma 公司；微管相关蛋白轻链3B抗体（LC3B，批号nb100）购于美国Novus Biologicals公司；ECL 化学发光试剂盒（批号P0018AS）购于上海碧云天生物技术研究所；BD FACS Calibur 流式细胞仪购于美国BD 公司；超微量分光光度计购于美国Thermo Fisher Scientific 公司，凝胶电泳仪购于美国Bio-Rad 公司；化学发光荧光影像分析仪购于日本富士胶片公司。

2 实验方法

2.1 细胞培养 人肺腺癌A549 细胞株（上海中国科学院细胞库提供）接种于含10%小牛血清的RPMI-1640 培养基，置于5%CO2，37℃培养箱中培养，2～3 天更换培养基，待细胞密度为80%～90%时，用胰酶消化，进行细胞传代。待细胞生长状态良好，进行后续实验。

2.2 细胞内活性氧水平检测 实验分为对照组、荜茇酰胺组和荜茇酰胺+NAC 组。对照组采用生理盐水处理A549 细胞48h，荜茇酰胺组采用3μM 荜茇酰胺处理A549 细胞48h，荜茇酰胺+NAC 组采用3μM荜茇酰胺和10mM NAC 处理A549 细胞48h。荜茇酰胺或NAC 处理A549 细胞后，将细胞与10μM DCFH-DA 在37℃下孵育30min。无血清RPMI-1640培养液洗涤细胞。使用BD FACS Calibur 流式细胞仪测定荧光强度，该值代表细胞内活性氧（ROS）水平。

2.3 CCK-8 法检测细胞活力 实验分为对照组、荜茇酰胺组，荜茇酰胺+NAC 组和3-甲基腺嘌呤+荜茇酰胺组。前三组处理同2.2，3-甲基腺嘌呤+荜茇酰胺组采用3μM 荜茇酰胺和3mM 3-甲基腺嘌呤处理A549 细胞48h。将A549 细胞（3000 个/孔）接种于96孔板中，置入培养箱中培养24h 后，加入荜茇酰胺、NAC 或自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤，采用超微量分光光度计测定在450nm 处各孔的吸光度（OD 值）。

2.4 蛋白质印迹 使用细胞裂解液裂解A549 细胞，BCA 法测定蛋白浓度。取30～60μg 总蛋白，经SDS-PAGE 电泳后转移至PVDF 膜上，用含5%脱脂牛奶的TBST 封闭2h，加入α-tubulin 或LC3B，4℃孵育过夜。TBST 漂洗3 次，将膜置于二抗中，室温下孵育1.5h，ECL 显影，置入化学发光荧光影像分析仪曝光，采用Image J 软件分析目的蛋白的相对灰度，计算公式为：目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/内参条带灰度值。

2.5 统计学方法 应用SPSS 20.0 软件进行数据处理，计量资料以均数±标准差（±s）表示，计量资料的两组间均数比较采用Student’s t 检验，多组间均数的比较采用单因素方差分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 各组A549 细胞ROS 水平比较 荜茇酰胺组A549 细胞ROS 水平显著高于对照组（P＜0.05），荜茇酰胺+NAC 组细胞ROS 水平低于荜茇酰胺组（P＜0.05），与对照组差异无统计学意义（P＞0.05），见表1、插页图1。

图1 各组A549 细胞ROS 水平比较

表1 各组A549 细胞ROS 水平比较（±s）

表1 各组A549 细胞ROS 水平比较（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与荜茇酰胺组比较，△P＜0.05；ROS：活性氧；NAC：N-乙酰-L-半胱氨酸

3.2 各组细胞活力比较 荜茇酰胺组细胞活力显著低于对照组（P＜0.05）。荜茇酰胺+NAC 组与对照组细胞活力差异无统计学意义（P＞0.05）。荜茇酰胺与NAC 合用后，细胞活力恢复至用药前水平，与荜茇酰胺组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 各组细胞活力比较（%，±s）

表2 各组细胞活力比较（%，±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与荜茇酰胺组比较，△P＜0.05；NAC：N-乙酰-L-半胱氨酸

3.3 各组A549 细胞LC3B-II 表达水平比较 荜茇酰胺组细胞LC3B-II 表达显著高于对照组（P＜0.05），荜茇酰胺与NAC 合用后，LC3B-II 表达下降至用药前水平。见插页图2。

图2 各组A549 细胞LC3B-Ⅱ表达水平

3.4 3-甲基腺嘌呤对荜茇酰胺抗肿瘤作用的影响3-甲基腺嘌呤+荜茇酰胺组LC3B-II 表达显著低于对照组和荜茇酰胺组（P 均＜0.05），3-甲基腺嘌呤+荜茇酰胺组A549 细胞活力显著低于荜茇酰胺组（P＜0.05）。见表3、插页图3。

表3 3-甲基腺嘌呤对荜茇酰胺抗肿瘤作用的影响（%，±s）

表3 3-甲基腺嘌呤对荜茇酰胺抗肿瘤作用的影响（%，±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与荜茇酰胺组比较，△P＜0.05

4 讨论

荜茇酰胺属生物碱类化合物，具有多种药理学作用。研究表明，荜茇酰胺选择性地抑制肿瘤细胞而不影响正常组织[4]。Raj 等[5]研究发现，荜茇酰胺增加肿瘤细胞的ROS 水平，但是其对正常细胞的ROS 水平无明显影响。正常细胞基础代谢水平较低，很少依赖ROS 应激反应途径。肿瘤细胞产生明显的氧化应激反应，为适应氧化应激反应，肿瘤细胞启动抗氧化防御系统，较大程度上依赖ROS 应激反应途径。因此，荜茇酰胺选择性地增加肿瘤细胞ROS 含量，进而抑制细胞增殖和迁移，诱导细胞凋亡[6]。本研究显示，荜茇酰胺提高肺癌细胞的ROS 水平，抑制细胞增殖，NAC 与荜茇酰胺合用能逆转荜茇酰胺介导的ROS 含量升高和细胞增殖抑制作用。这提示荜茇酰胺可能通过调节ROS 依赖途径抑制肺癌细胞增殖。

自噬是存在于真核细胞内的一种依赖溶酶体途径的蛋白质和细胞器降解过程。与肺癌、肺动脉高压、慢性阻塞性肺病、急性肺损伤和呼吸道感染等多种肺部疾病的发生、发展密切相关[5，7]。LC3B 在自噬过程中扮演重要角色，常被作为监测巨自噬发生的特异性标志蛋白[8-9]。本研究显示，荜茇酰胺处理肺癌细胞，LC3B-II 表达显著增加，与NAC 合用逆转荜茇酰胺介导的LC3B-II 升高。这提示荜茇酰胺参与调节ROS 依赖的细胞自噬。

肺癌细胞自噬水平升高，并依赖自噬来维持细胞生长和存活所需的线粒体功能和细胞代谢[10-11]。本研究将自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤处理肺癌细胞，LC3B-II 表达显著降低。3-甲基腺嘌呤和荜茇酰胺联用明显增强荜茇酰胺的抗肿瘤作用。

综上所述，本研究发现荜茇酰胺通过调节ROS依赖途径，抑制肺癌细胞增殖，促进细胞自噬。自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤降低肺癌细胞自噬，增强荜茇酰胺的抗肿瘤作用。