负载利福平骨水泥的制备及体外释放实验研究

余涌杰 赖 震 费 骏 胡胜平

骨关节结核是危害严重的疾病，药物难以达到病灶，导致骨结核迁延不愈。骨关节结核常采用病灶清除后局部辅以抗结核药物，然而抗结核药物在局部迅速扩散，难以长时间维持有效浓度。本实验通过现代骨水泥技术，构建负载不同剂量利福平的骨水泥，并研究负载利福平骨水泥的药物释放浓度行为，为优化抗结核骨水泥提供理论依据。

1 实验材料

1.1 药 品 利福平胶囊，浙江医药股份有限公司新昌制药厂，批号180406。

1.2 试 剂 氢氧化钠（NaOH），规格：AR500g，国药集团化学试剂有限公司，批号1 310732；磷酸二氢钠（NaH2PO4），规格：AR500g，国药集团化学试剂有限公司，批号13 472350；磷酸钠（Na2HPO4），规格：AR500g，国药集团化学试剂有限公司，批号20 040618；氯仿，规格：AR500mL，广州化学试剂厂，批号20 150910；盐酸（HCl），规格：AR500mL，广州化学试剂厂，批号20 150716；溴甲酚绿，规格：AR500g，上海凌峰化学试剂有限公司，批号76-60-8。

2 方 法

2.1 实验分组 根据负载利福平剂量不同将载药骨水泥分为三组，实验1 组：负载0.75g 利福平骨水泥，实验2 组：负载1.5g 利福平骨水泥，实验3 组：负载2.25g 利福平骨水泥，对照组为国际标准化（International Organization for Standardization，ISO）组。

2.2 负载利福平骨水泥样品制备 将利福平胶囊按0.75、1.5、2.25g 剂量分别与40g 骨水泥在无菌条件下真空搅拌，并加入骨水泥单体15mL，继续搅拌2min 后，加入由聚乙烯制成的模具之中塑形，制成直径6mm、厚度3mm 的矮圆柱体实验样品，每组制备6 个。

2.3 负载不同剂量利福平抗结核骨水泥物理特性测定（1）面团时间测定从骨水泥粉剂与液相混合开始，每隔15s 用带外科手套的手指轻轻探触暴露的骨水泥表面，直至手指能干净地与骨水泥表明分离，而不粘有纤丝的时间为面团时间；（2）凝固时间测定从混合开始至水泥达到最高温度，两者中所需时间为凝固时间[1-2]。

2.4 体外药物释放实验（1）将负载不同剂量的利福平骨水泥和空白样骨水泥浸泡于50mL 生理盐水中；（2）震荡加热，温度设为：37℃；（3）3 天取样1 次，并且将样品再次浸泡于50mL 新鲜生理盐水中，继续释放，共释放15 天；（4）用紫外可见光分光光度计，对释放液在474nm 处检测吸光值，并记录好数据；（5）药品浓度与吸光值A 之间的线性回归方程为：A=0.0741C+0.0005，r=0.9996，在1.0～25.0μg/mL 范围内有良好的线性关系。

3 结果

3.1 负载不同剂量利福平骨水泥的面团时间和凝固时间比较 负载不同剂量利福平后，骨水泥的面团时间和凝固时间均大于对照组（国际标准化3～15s），利福平剂量越大，面团时间和凝固时间越长，三组之间差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 各组骨水泥物理特性测试比较（min，±s）

表1 各组骨水泥物理特性测试比较（min，±s）

注：与实验1 组比较，*P＜0.05；与实验2 组比较，△P＜0.05；实验1 组为负载0.75g 利福平骨水泥；实验2 组为负载1.5g 利福平骨水泥；实验3 组为负载2.25g 利福平骨水泥

3.2 不同时间点负载不同剂量利福平骨水泥体外药物释放结果比较 在生理盐水中浸泡后，骨水泥基体中的利福平会逐渐释放，在前3 天药物释放速率比较平缓，三组间差异有统计学意义（P＜0.05）。3 天后利福平释放开始逐渐加快，在第6 天时三组间差异有统计学意义（P＜0.05），达到释放高峰，此后释放减慢，到第9 天时三组间差异有统计学意义（P＜0.05），药物的释放状态达到平稳缓释效果，在第12天时三组间差异无统计学意义（P＞0.05）。这种平稳状态并持续释放到实验结束，第15 天时三组间差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

4 讨论

骨关节结核治疗过程中，抗结核药物很难在病灶局部达到有效浓度，这是骨关节结核难以治愈的主要原因[3]。研究显示，在骨关节结核病灶中，病灶周围的硬化骨会阻碍抗结核药物向病灶渗透，血液和病灶外围健康组织中的结核药物不能充分扩散到患者的结核病灶中的脓肿和干酪组织坏死中，因此在病灶部位填充一定的生物材料，填充材料可在局部长期缓慢释放抗结核药物，可以提高疗效[4]。载利福平骨水泥复合体，具有良好的生物相容性，负载利福平骨水泥可有效避免局部使用抗结核药物的突释，在局部维持一定抗结核药物缓慢，有望改善现有治疗骨结核过程中出现骨缺损生物替代材料和局部用药的不足，是一种行之有效的治疗途径[5]。

采用现代骨水泥技术将利福平与骨水泥在真空无菌条件下混合，可最大限度降低负载抗结核药物对骨水泥理化性质的影响。测定负载不同剂量利福平骨水泥的面团时间和凝固时间结果，可以评估载药骨水泥的理化性质变化，是判断载药骨水泥能否在临床中应用的重要依据。本实验研究发现负载不同剂量的利福平后，骨水泥的面团时间和凝固时间均大于对照组，利福平剂量越大，面团时间和凝固时间越长。骨水泥负载药物后，药物会在骨水泥固-液表面产生一定的正吸附，随着界面上负载的药物浓度增加，骨水泥表面自由能就降低，使骨水泥的面团时间和凝固时间延长，虽然负载不同剂量的利福平后，骨水泥的面团时间和凝固时间均大于对照组，但利福平的存在并不影响骨水泥载体的最终产物性能，符合临床应用的需要[6]。

本研究结果显示，负载利福平骨水泥在前3 天药物释放初期释放速率比较平缓，第3 天后利福平释放开始逐渐加快存在突释效应，在第6 天时达到了释放的高峰，三组间差异有统计学意义（P＜0.05），因为初期的药物释放主要是骨水泥表面利福平的快速释放，随着药物的不断释放，载体表面的利福平释放逐渐减少，骨水泥内部的药物释放占据主导[7]。到第9 天时药物的释放状态达到平稳缓释效果，在第12 天和第15 天时检测各组释放情况，三组间差异无统计学意义（P＞0.05）。利福平药物含量的骨水泥样品中药物释放情况与时间相关，其与Ginelma 等[8]研究一致，负载利福平骨水泥中的药物是通过骨水泥载体中的微孔来扩散释放，所以其利福平的释放率与药物在基质骨水泥中的分布有关，药物从微孔内通过扩散机制释放，药物释放速率与利福平药物在骨水泥内的扩散度有关，而与厚度无关。负载利福平骨水泥则能有效维持局部药物浓度，有效控制了常见的药物突释效应，从而在骨关节结核病灶治疗中起到维持治疗剂量的局部药物浓度，有利于病灶局部结核的控制，具有良好的应用前景。

目前本研究仅限于体外实验，药物的体外释放特性不能代表其临床治疗特性，其疗效仍需进一步研究确定。

表2 不同时间点各组负载利福平骨水泥药物释放测试结果比较（μg/mL，±s）

表2 不同时间点各组负载利福平骨水泥药物释放测试结果比较（μg/mL，±s）

注：与实验1 组比较，*P＜0.05；与实验2 组比较，△P＜0.05；实验1 组为负载0.75g 利福平骨水泥；实验2 组为负载1.5g 利福平骨水泥；实验3 组为负载2.25g 利福平骨水泥