阿克苏地区羊感染无浆体病情况调查分析

李佳 段真真 杨世忠

摘要    为了解阿克苏地区羊无浆体病流行分布情况，采用PCR方法对965份羊抗凝血样品进行了检测。结果显示，羊血液样品中检出2种无浆体，分别为嗜吞噬细胞无浆体和绵羊无浆体，阳性率分别为29.43%（284/965）和33.16%（320/965），差异无统计学意义（χ2=3.12，P>0.05）;舍饲和散养条件下，嗜吞噬细胞无浆体阳性率分别为4.04%（19/470）和53.54%（265/495）（χ2=284.35，P<0.05），绵羊无浆体阳性率分别为21.49%（101/470）和44.24%（219/495）（χ2=56.31，P<0.05）。调查结果表明，阿克苏地区是羊无浆体病流行地区。

关键词    无浆体病;羊;流行情况;新疆阿克苏

中图分类号    S826         文献标识码    A

文章编号   1007-5739（2019）18-0167-01                                                                                     开放科学（资源服务）标识码（OSID）

无浆体病是由无浆体寄生于动物红细胞内引起的一种血液性疾病[1-3]，广泛分布于世界各地。我国自20世纪80年代首次在绒山羊体内发现无浆体病以来，先后在山东、云南、新疆、西藏等地发现，对养羊业的可持续发展造成了影响[4-5]。羊感染无浆体病后临床症状以高热、贫血、渐进性消瘦、黄疸等为特征，严重感染时会引起死亡[6]。

为了解新疆阿克苏地区羊感染无浆体病情况，并为羊无浆体病的防控提供参考，本研究应用 PCR方法对阿克苏地区辖内9个县市羊感染无浆体病情况进行了调查。

1    材料与方法

1.1    主要试剂

全血DNA提取试剂盒、Premix Ex Taq、聚合酶等均购自大连宝生物工程有限公司;引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2    试验方法

1.2.1    样品采集。2017—2018年，从新疆阿克苏地区9个县市随机采集舍饲和散养羊，无菌采集965份羊抗凝血，提取全血基因组DNA，-20 ℃保存待检。

1.2.2    PCR检测。利用已报道的无浆体引物[7-8]，嗜吞噬细胞无浆体基因扩增程序：第1轮引物EE1/EE2（EE1：5′-TCC-TGGCTCAGAACGAACGCTGGCGGC-3′;EE2：5′-GTCACTG-ACCCAACCTTAAATGGCTG-3′），反应条件为：94 ℃预变性2 min;94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，35个循环，72 ℃延伸10 min。第2轮扩增引物SSAP2f/SSAP2r（SS-AP2f：5′-GCTGAATGTGGGGATAATTTAT-3′;SSAP2r：5′-ATGGCTGCTTCCTTTCGGTTA-3′），反应条件与第1轮相同，预期扩增目的片段长度为641 bp。绵羊无浆体特异性扩增引物MSP4-F/MSP4-R（MSP4-F：5′-CCGGATCCTTAGCTGAA-CAGGAATCTTGC-3′;MSP4-R：5′-GGGAGCTCCTATGAAT-TACAGAGAATTGTTTAC-3′）扩增反应条件为：94 ℃预变性2 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，35个循环，72 ℃延伸10 min，预期扩增目的片段长度为867 bp。取5 μL扩增产物，在1%琼脂糖凝胶中电泳，在电泳凝胶成像系统仪中拍照。

1.3    统计学分析

应用SPSS 22.0 分析软件对调查数据进行分析，计算羊感染无浆体病情况，采用χ2检验比较检测数据的差异。检验水准为α=0.05。

2    结果与分析

2.1    PCR检测

对提取的965 份核酸样品经PCR检测，结果检出嗜吞噬细胞无浆体和绵羊无浆体，检出片段的大小与预期一致（图1、2）。

2.2    不同县市羊感染情况

对阿克苏地区9个县市随机采集的965份样品经PCR检测，检测结果显示，9个县市羊均有感染无浆体病情况，绵羊无浆体阳性率为33.16%（320/965），嗜吞噬细胞无浆体阳性率为29.43%（284/965），差异无统计学意义（χ2=3.12，P>0.05），绵羊无浆体和嗜吞噬细胞无浆体混合感染阳性率为15.54%（150/965）（表1）。

2.3    不同飼养模式羊感染情况

965份核酸样品经PCR检测，不同饲养模式的羊感染无浆体病的情况见表2。可以看出，舍饲和散养条件下嗜吞噬细胞无浆体阳性率分别为4.04%（19/470）和53.54%（265/495），差异有统计学意义（χ2=284.35，P<0.05），绵羊无浆体阳性率分别为21.49%（101/470）和44.24%（219/495），差异有统计学意义（χ2=56.31，P<0.05）。

3    结论与讨论

目前，基层兽医部门检测无浆体病主要以血液涂片染色镜检为主，但是血液涂片染色鏡检受制于操作人员操作技能、专业知识储备和染色技术，漏检、误检情况较普遍。分子生物学方法比血液涂片染色镜检更为灵敏、特异，适合应用于高通量检测。

本次调查结果发现，阿克苏地区9个县市羊均有感染无浆体病情况，绵羊无浆体阳性率（33.16%，320/965）高于嗜吞噬细胞无浆体（29.43%，284/965），差异无统计学意义（χ2=3.12，P>0.05），绵羊无浆体在各县市流行情况差异显著，其中新和县最高（90.48%，19/21），拜城县最低（16.88%，13/77），差异有统计学意义（χ2=40.64，P<0.05）;嗜吞噬细胞无浆体在各县市流行情况差异显著，其中柯坪县最高（100%，21/21），库车县最低（15.86%，56/353），差异有统计学意义（χ2=85.82，P<0.05）。调查结果发现，绵羊无浆体在舍饲和散养条件下阳性率分别为21.49%（101/470）和44.24%（219/495）（χ2=56.31，P<0.05）;嗜吞噬细胞无浆体在舍饲和散养条件下阳性率分别为4.04%（19/470）和53.54%（265/495）（χ2=284.35，P<0.05）。以上说明舍饲羊饲养管理优于散养羊，舍饲羊管理相对集中，与外界环境接触较少，定期驱虫以及圈舍消毒，被蜱虫叮咬的风险小于散养羊。

4    参考文献

[1] 孟庆玲，乔军，盛金良，等.古尔班通古特沙漠南缘蜱携带无形体的调查[J].中国兽医学报，2012，32（8）：1158-1163.

[2] 李烛南，卢怡竹，王振国，等.新疆昭苏县马感染嗜吞噬细胞无浆体血清学与分子生物学调查[J].动物医学进展，2018，39（7）：47-51.

[3] 闻秀秀，王宁，苏布赛，等.新疆部分地区优势种革蜱携带绵羊无浆体的检测及其进化关系[J].中国兽医学报，2018，38（9）：1699-1703.

[4] 迟庆安，刘志杰，李有全，等.中国南方七省份牛无浆体病的流行病学调查[J].中国兽医科学，2014，44（1）：98-103.

[5] 张玉婷，孟元，郭庆勇，等.新疆革蜱源性绵羊无浆体病原DNA检测[J].新疆农业科学，2016，53（1）：185-189.

[6] 彭永帅.河南省羊源硬蜱种类鉴定及无浆体、梨形虫携带情况调查[D].郑州：河南农业大学，2013.

[7] 周作勇，王芝英，胡世君，等.山羊无浆体16S rRNA、MSP4和GroEL（HSP60）基因的克隆测序及分析[J].中国兽医学报，2014，34（3）：415-421.

[8] 崔艳艳，王晓星，张艳，等.嗜吞噬细胞无浆体SYBR Green I荧光定量PCR检测方法的建立及应用[J].中国兽医学报，2018，38（4）：722-726.