含解淀粉芽孢杆菌LTBA02的复合微生物肥料对柑橘红蜘蛛的防效研究

陈裕新 吕昆明 周伟东

摘要    本文研究了含解淀粉芽孢杆菌LTBA02的复合微生物肥料中脂肪酶和淀粉酶的活性，以及对柑橘红蜘蛛的田间防治效果。结果表明，含解淀粉芽孢杆菌LTBA02的复合微生物肥料的脂肪酶活性和淀粉酶活性分别达到3.77、18.14 U/g，酶活力没有因肥料高盐环境而失活，仍具有较高的生物活性;施后1、3、7、20 d，含解淀粉芽孢杆菌LTBA02的复合微生物肥料100、150、200倍液处理都表现出很好的防治柑橘红蜘蛛的效果，都显著高于110 g/L乙螨唑悬浮剂4 400倍液处理和不添加解淀粉芽孢杆菌LTBA02的复合微生物肥料100倍液处理;含解淀粉芽孢杆菌LTBA02的复合微生物肥料200倍液处理喷后1 d防治效果达到90.28%，喷后20d防治效果达到了97.39%，表现出了良好的速效性和持效性。

关键词    解淀粉芽孢杆菌;复合微生物肥料;柑橘红蜘蛛;防治效果

中图分类号    S436.611.2+9         文献标识码    A

文章编号   1007-5739（2019）18-0070-03                                                                                     开放科学（资源服务）标识码（OSID）

Abstract    The activity of lipase and amylase in compound microbial fertilizer containing Bacillus amyloliquefaciens LTBA02 was measured，and the field control effect of the fertilizer on Panonychus citri McGregor was studied.The results showed that the lipase activity and amylase activity of the composite microbial fertilizer containing Bacillus amyloliquefaciens LTBA02 reached 3.77 U/g and 18.14 U/g，respectively.The enzyme activity was not inactivated due to the high salt environment of the fertilizer，and it still had a high biological activity.1，3，7，20 d after application，100，150，200 times solution of compound microbial fertilizer containing Bacillus amyloliquefaciens LTBA02 showed good effect of controlling Panonychus citri McGregor，which was significantly higher than 110 g/L etoxazole flowable agent 4 400 times treatment and 100 times solution treatment of the composite microbial fertilizer without adding Bacillus amyloliquefaciens LTBA02.The control effect of 200 times solution treatment of compound microbial fertilizer containing B.amyloliquefaciens LTBA02  reached 90.28% after spraying 1 d，the control effect of that reached 97.39% after spraying 20 days，showed good quick-acting and long-lasting effect.

Key words    Bacillus amyloliquefaciens;compound microbial fertilizer;Panonychus citri McGregor;control effect

解淀粉芽孢杆菌是一种好氧产芽孢的革兰氏阳性杆状细菌，在自然界中分布广泛，可在土壤、植物根际体表、深海水中、植物体内等环境中存在。解淀粉芽孢杆菌在生长过程中可以产生一系列能够抑制动植物和微生物生长的代谢产物，因而其具有生物除污、植物促生及生物防治等特性[1]。由于解淀粉芽孢杆菌具有高效性，且对环境无殘留危害，从而引起了国内外广大科技工作者的重视。已有研究表明，解淀粉芽孢杆菌具有分泌解淀粉酶、蛋白酶、凝乳酶、植酸酶、几丁质酶、葡聚糖酶、脂肪酶等胞外酶以及表面活性素、芬荠素、伊枯草菌素和杆菌抗霉素等抗生素、抗菌蛋白质多肽类代谢产物的能力[2]，因而被广泛应用在环境保护、农作物病虫害防治[3]和动物养殖[4]等方面。

解淀粉芽孢杆菌LTBA02菌株是广西乐土生物科技有限公司从环境中分离纯化得到，并于2018年7月备案中国典型培养物保藏中心（武汉），保藏编号CCTCC NO：M20184

33。研究发现，解淀粉芽孢杆菌LTBA02菌株具有较强的分解脂肪酶和淀粉酶能力，能酶解柑橘红蜘蛛表皮蜡质，造成红蜘蛛闭吸或死亡[5]。

根据菌株具有酶解柑橘红蜘蛛表皮蜡质，造成红蜘蛛闭吸或死亡的特性，拟将其添加到复合微生物肥料产品中，开发成具有生物防治柑橘红蜘蛛的特种肥料。本研究旨在验证含解淀粉芽孢杆菌LTBA02的复合微生物肥料对柑橘红蜘蛛是否有防治效果，研究该产品的使用方法，为该产品的开发和推广应用提供参考。

1    材料与方法

1.1    试验地概况

试验地选在南宁市武鸣区双桥镇造庆村柑橘园，柑橘树龄3年，田间柑橘树长势均匀，肥水管理一致，种植规格2.5 m×3.0 m，施药时田间柑橘红蜘蛛成、若螨共存。试验前10 d及试验期间未对其他非靶标生物进行施药防治。试验区土壤为砂质壤土，有机质含量中等。

1.2    试验材料

供试肥料和药剂为含解淀粉芽孢杆菌LTBA02的复合微生物肥料（由广西乐土生物科技有限公司配制，有效活菌数≥0.2亿个/g，N+P2O5+K2O≥25%，有机质≥20%，粉剂，全水溶）;不添加解淀粉芽孢杆菌LTBA02的复合微生物肥料产品（由广西乐土生物科技有限公司配制，N+P2O5+K2O≥25%，有机质≥20%，粉剂，全水溶）;110 g/L乙螨唑悬浮剂（日本住友化学株式会社产品，登记证号：PD20120215）。供试作物为柑橘（沃柑）。防治对象为柑橘红蜘蛛。

1.3    试验设计

试验设6个处理，即施用含解淀粉芽孢杆菌LTBA02的复合微生物肥料100倍液（A）、150倍液（B）、200倍液（C），不添加解淀粉芽孢杆菌LTBA02的复合微生物肥料100倍液（D），110 g/L乙螨唑悬浮剂4 400倍液（有效成分含量为25 mg/kg）（E），以清水作对照（CK）。3次重复，随机区组排列。每个小区3株柑橘。

1.4    施药方法

采用背负式电动喷雾器喷雾，供试药物用清水稀释后，对柑橘植株叶片正、反面进行均匀喷雾;空白对照区喷等量清水。2018年8月9日，柑橘红蜘蛛发生高峰前期施药（红蜘蛛种群数为5～8头/叶），试验期间施1次药。每株喷药液1.5 L，折合喷药液1 800 L/hm2。试验期间未使用杀虫剂。

1.5    试验期间气象资料

施药当天晴间多云，日均温度30.4 ℃，东南风0～1级，施药后2 d无雨;试验期间降雨天数8 d，累计降雨量90.7 mm，其中大雨2次;平均气温29.7 ℃，最高36.7 ℃，最低23 ℃。

1.6    测定指标

1.6.1    含解淀粉芽孢杆菌LTBA02的复合微生物肥料产品中脂肪酶活性的测定。

（1）药品配制和待测样品液的制备。①底物溶液：精确称取聚乙烯醇（聚合度1 750±50）40 g，加水800 mL，在沸水浴中加热，搅拌，直至全部溶解，冷却后定容至1 000 mL，用干净的双层纱布过滤，取滤液备用。量取上述滤液150 mL，加橄榄油50 mL，用高速匀浆机处理6 min（分2次处理，间隔5 min，每次处理3 min），即得配制好的底物溶液。该溶液应现用现配。②磷酸缓冲液：分别称取磷酸二氢钾1.96 g和十二水磷酸氢二钠39.62 g，用水溶解并定容至500 mL，配好后应以酸度计校正pH值到7.5。③氫氧化钠标准溶液：按GB/T 601配制与标定，制备成 0.05 mol/L氢氧化钠标准溶液。④待测样品液：称取待测样品1～2 g，用磷酸缓冲液溶解并稀释。测定时控制待测样品液浓度，样品与对照消耗碱量之差控制在1～2 mL范围内。

（2）脂肪酶活力的检测分析。取2个100 mL三角瓶，分别作为空白A和样品B，分别加入底物溶液4 mL和磷酸缓冲液5 mL，再于A中加入95%酒精15 mL，于（40.0±0.2）℃水浴锅中预热5 min，然后各加1 mL待测样品液，立即混匀计时，准确反应15 min后，于B中立即补加15 mL 95%酒精终止反应，取出。于A、B瓶中各加入酚酞指示液2滴，用0.05 mol/L氢氧化钠标准溶液滴定，直至微红色并保持30 s不褪色为滴定终点，记录消耗氢氧化钠标准溶液的体积。

（3）酶活力计算。1 g固体样品在40 ℃和pH值7.5条件下，1 min水解底物产生1 μmol的可滴定的脂肪酸，即为1个酶活力单位，以U/g表示。计算公式：

式中：X—样品脂肪酶活力，单位为U/g;V1—滴定样品时消耗氢氧化钠标准溶液的体积，单位为mL;V2—滴定空白时消耗氢氧化钠标准溶液的体积，单位为mL;C—氢氧化钠标准溶液，单位为mol/L;50—0.05 mol/L氢氧化钠溶液1.00 mL相当于脂肪酸50 μmol;n—样品的稀释倍数;0.05—氢氧化钠标准溶液浓度换算系数;15—反应时间15 min，以1 min计算。

1.6.2    含解淀粉芽孢杆菌LTBA02的复合微生物肥料产品中淀粉酶活性的测定。

（1）药品配制和待测样品液的制备。①稀碘液：称取结晶碘11 g、碘化钾22 g，先用少量蒸馏水使碘完全溶解后，再加蒸馏水定容至500 mL，即得原碘液;取原碘液2 mL，加碘化钾20 g，加蒸馏水溶解定容至500 mL，即得稀碘液，贮于棕色瓶内备用。②2%可溶性淀粉：称取2 g可溶性淀粉，用少量水调成浆状物，边搅拌边缓慢加入70 mL沸水中，然后用水分次冲洗装淀粉的烧杯，洗液倒入其中，搅拌加热至完全透明，冷却定容至100 mL。现配现用。③磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液：称取十二水磷酸氢二钠45.23 g和柠檬酸8.07 g，用蒸馏水溶解定容至1 000 mL，配好后应以酸度计校正pH值为6.0。④待测样品液：称取待测样品1～2 g，先用少量40 ℃的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液溶解，并用玻璃棒捣碎，将上层清液小心倾入适当的容量瓶中，沉渣部分再加入少量上述缓冲溶液，如此反复研捣3～4次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲溶液定容至刻度，摇匀，通过4层纱布过滤，再用滤纸滤清，滤液供测定用。

（2）淀粉酶活力的检测分析。于白瓷板空穴内滴入稀碘液1.5 mL。取2%可溶性淀粉20 mL和磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液5 mL于25 mm×200 mm试管中，于60 ℃恒温水溶中预热4～5 min。随后加入预先稀释好的待测样品液0.5 mL，立即计时，充分摇匀，定时用吸管取出反应液0.5 mL，滴于预先滴有稀碘液的瓷板穴内，当穴内颜色由紫色逐渐变为红棕色，即为反应终点，记录时间。酶反应全部时间控制在2.0～2.5 min范围内，测定时照明采用日光灯。

（3）酶活力计算。1 g固体样品在60 ℃和pH 值6.0条件下，1 h降解1 g可溶性淀粉，即为1个酶活力单位，以U/g表示。计算公式：

其中：W—样品淀粉酶活性，单位为U/g;T—测定时间，单位为min;60—60 min;20—吸取可溶性淀粉的体积，单位为mL;2%—可溶性淀粉溶液浓度;n—待测样品稀释倍数;0.5—测定时稀酶液吸取量，单位为mL。

1.6.3    含解淀粉芽孢杆菌LTBA02的复合微生物肥料产品田间防治柑橘红蜘蛛效果。喷药前进行螨口基数调查，药后1、3、7、20 d调查活螨数。试验期间共调查5次。调查方法为每小区定株调查2株，在植株的4个方位标记嫩梢，每梢查叶片5片，每株调查20片叶的存活螨数;与CK比较，计算相对防效。药效计算公式如下：

式中：CK0为对照区药前活螨数;CK1为对照区药后活螨数;PT0为处理区药前活螨数;PT1为处理区药后活螨数。

1.7    数据处理

防效方差分析采用DPSv 6.55版专业软件按DMRT法进行处理。

2    结果与分析

2.1    含解淀粉芽孢杆菌LTBA02的复合微生物肥料产品中脂肪酶和淀粉酶活性分析

添加有含解淀粉芽孢杆菌LTBA02的复合微生物肥料，其脂肪酶活性和淀粉酶活性仍保持较高酶活，分别达到3.77 、18.14 U/g;不添加解淀粉芽孢杆菌LTBA02的复合微生物肥料脂肪酶活性和淀粉酶活性分别为0.25、0.44 U/g，虽能检测出部分酶活力，但相对供试产品相差甚远。这说明解淀粉芽孢杆菌LTBA02菌株在肥料中仍具有较高的生物活性，其酶活没有因肥料高盐环境而失活。

2.2    含解淀粉芽孢桿菌LTBA02的复合微生物肥料产品田间防治柑橘红蜘蛛效果分析

从表1可知，处理A、B、C药后1、3、7、20 d都表现出很好的防效;其中处理C药后1 d防治效果达到90.28%，药后20 d防治效果达到了97.39%，表现出了良好的速效性和持效性。处理D随时间推移防效逐渐降低，药后20 d防治效果仅为12.39%，这说明了解淀粉芽孢杆菌LTBA02在防治柑橘红蜘蛛中起到了关键性的作用。在试验浓度下，供试产品对柑橘安全，未发现药害。

方差分析可知，处理A、B、C药后1、3、7、20 d的防效随药剂使用浓度提高而有所提高，但差异均不显著。处理A、B、C的防效均极显著高于处理E和处理D。

3    结论与讨论

酶活检测结果表明，添加有含解淀粉芽孢杆菌LTBA02的复合微生物肥料，其脂肪酶活性和淀粉酶活性仍保持较高的酶活，脂肪酶活性和淀粉酶活性比不添加解淀粉芽孢杆菌LTBA02的复合微生物肥料高。这说明解淀粉芽孢杆菌LTBA02菌株在肥料中仍具有较高的生物活性，其酶活没有因肥料高盐环境而失活。高盐状态下普通酶的空间结构会发生改变，酶活性以及酶的作用位点都可能发生改变[6-7]，但供试产品中，其酶活并未因肥料中的高盐成分影响而失活，这可能在酶活检测中或产品使用中，需要将样品进行兑水溶解并稀释，而高盐使酶活性失活是一种可逆暂时性失活，当外部盐度降低后，酶活性逐渐恢复。

田间药效试验结果表明，不添加解淀粉芽孢杆菌LTB-A02的复合微生物肥料，在一定使用浓度下也能对柑橘红蜘蛛造成伤害，形成一定防效。但含解淀粉芽孢杆菌LTBA02的复合微生物肥料防治柑橘红蜘蛛在速效性和持久性方面都显著优于不添加解淀粉芽孢杆菌LTBA02的复合微生物肥料，说明解淀粉芽孢杆菌LTBA02菌株的生物活性成分在防治柑橘红蜘蛛上具有关键性作用。这可能是在喷施过程中，肥料中氮磷钾盐分首先对柑橘红蜘蛛造成高盐伤害，这种伤害是接触性物理伤害，其后解淀粉芽孢杆菌LTBA02菌株的生物活性成分脂肪酶、解淀粉酶进一步加速伤口的破坏，使其无法恢复，造成柑橘红蜘蛛死亡。肥料中的高盐和解淀粉芽孢杆菌LTBA02的生物活性成分的交叉作用，才形成了供试产品在防治柑橘红蜘蛛方面良好的速效性和持久性。

含解淀粉芽孢杆菌LTBA02的复合微生物肥料产品对防治柑橘红蜘蛛具有显著效果，其100倍液、150倍液、200倍液处理的使用效果都显著优于对照药剂110 g/L乙螨唑悬浮剂4 400倍液（有效成分含量25 mg/kg）处理的防效，并且具有良好的速效性和持久性。在试验浓度下，含解淀粉芽孢杆菌LTBA02的复合微生物肥料对柑橘安全，未发现药害。综合防治效果和使用成本，推荐使用浓度为150～200倍液。

4    参考文献

[1] 陈哲，黄静，赵佳，等.解淀粉芽孢杆菌抑菌机制的研究进展[J].生物技术通报，2015，31（6）：37-41.

[2] 出晓铭，林毅雄，张砷，等.生防菌解淀粉芽孢杆菌抗菌蛋白的研究进展[J].包装与食品机械，2014，32（6）：49-54.

[3] 蒋昐昐，陈志谊，甘颖，等.解淀粉芽孢杆菌B1619对设施蔬菜根结线虫病的防治效果[J].江苏农业科学，2017，45（12）：81-84.

[4] 王美玲，吴骏晨，朱赟程，等.解淀粉芽孢杆菌在动物生产中应用的研究进展[J].中国畜牧杂志，2017，53（2）：19-23.

[5] 廖华，吕昆明.一种解淀粉芽孢杆菌菌株及其筛选方法：中国，201811038216.1[P].2018-09-06.

[6] 柳旭东，张利民，王际英，等.盐度对水产动物组织中酶活力的影响[J].养殖与饲料，2008（11）：68-71.

[7] 许星鸿，朱晓莹，阙义进，等.pH、温度和盐度对单环刺消化酶和溶菌酶活力的影响[J].水产科学，2017，36（2）：138-142.