P-EGFR、P-ERK及NF-κB在中耳胆脂瘤上皮组织中的表达研究

朱元良

摘要：目的：探讨磷酸化表皮生长因子受体（P-EGFR）、磷酸化细胞外信号调节激酶（P-ERK）及细胞核转录因子（NF-κB）在中耳胆脂瘤上皮组织中的表达。方法：选取本院于2018年5月-2019年5月收治的中耳胆脂瘤患者28例及正常外耳道患者13例，采用Western blot（WB）免疫印迹法、免疫组织化学SP法检测其皮肤组织当中NF-κB、P-ERK、P-EGFR的表达。结果：P-EGFR蛋白阳性表达多定位在细胞膜与细胞质，NF-κB蛋白阳性表达多定位在细胞核，二者在胆脂瘤组阳性表达率均较正常外耳道皮肤组偏高（P<0.05）。经WB免疫印迹法检测得知，中耳胆脂瘤组P-ERK、P-EGFR与NF-κB的表达量相比正常耳道皮肤组，表达量均有显著升高（P<0.05）。结论：于中耳胆脂瘤上皮中，P-EGFR、P-ERK与NF-κB的表达均有增强，在此病症形成与发展中，P-EGFR/P-ERK/NF-κB信号通路可能其重要作用。

关键词：P-EGFR;P-ERK;NF-κB;中耳胆脂瘤

中耳胆脂瘤实为一种比较常见的耳科常见病，尽管为良性，但却有着较强的复发性、破坏性与侵袭性，且有着并未明确的发病机制，有报道[1]指出，此病发生可能与胆脂瘤上皮细胞的凋亡、紊乱、过度增殖相关。伴随当今分子生物技术的持续更新与完善，胆脂瘤发病机制当中，细胞因子所起到的作用越发受到重视。本文针对中耳胆脂瘤的上皮组织，就磷酸化表皮生长因子受体（P-EGFR）、磷酸化细胞外信号调节激酶（P-ERK）及细胞核转录因子（NF-κB）在其中的表达情况作一探讨。

1.材料与方法

1.1组织标本与试剂

于2018年5月-2019年5月，选取本院收治的28例后天性中耳胆脂瘤患者，将其当作观察组，另选取15例外耳道正常患者为对照组，均取其皮肤组织标本，将一半用石蜡包埋并切片，并苏木精-伊红进行染色，而另外一半则放置到液氮中，当作WB的实验组织标本。

试剂为：ECL发光液（美国Thermo pierce）、RIPA裂解液（北京普利莱）、鼠抗人P-ERK单克隆抗体、兔抗人P-EGFR多克隆抗体（均购自SantaCruz公司）。

1.2实验方法

1.2.1免疫组织化学实验

先进行烤片、脱蜡、水化等操作，基于0.01M枸橼酸钾缓冲液持续高压下，实施抗原修复。利用山羊血清实施有针对性的抗原封闭，然后，孵育一抗，放入冰箱中（4℃）。过夜后，第2d复温，使其温度达室温，用PBS进行浸泡，然后孵育二抗，时间为15min，采用PBS进行冲洗，后于室温下，对辣根酶标记链霉卵白素进行孵育（时间为15min），PBS进行冲洗。利用二氨基联苯胺（DAB）进行染色，于显微镜直视下，对反应时间进行控制。已知晓的阳性切片当作阳性对照，而将PBS缓冲液代替一抗当作阴性对照。

1.2.2WB免疫印迹法

取组织，用冰将PBS预冷，后对组织进行清洗，在匀浆器中，将RIPA裂解液加入，对组织进行反复研磨，直至组织块消失。放在冰上，裂解蛋白，时间为30min。移到离心管，12000rpm，温度为4℃，时间为15min，离心处理，转移上清液，备用。对蛋白浓度进行检测，实施配胶、上样等操作，调节浓缩胶电泳的电压，即80V，将分离胶的电泳电压控制在120V，當溴酚蓝电泳到离胶底大约1cm时，将电泳终止。孵育一抗、二抗，用ECL 化学发光液显影，用定影液将显色终止。曝光底片后，扫描操作，专业灰度分析软件（quantity one）分析。

1.3统计学处理

SPSS20.0处理数据，百分率表示计数资料（X2检验），P<0.05表示差异显著。

2.结果

细胞膜与细胞质为P-EGFR蛋白阳性表达的主要定位处，其于胆脂瘤组阳性表达率为57.14%（16/28），较正常外耳道皮肤组10.71%（3/28），显著偏高（P<0.05）。NF-κB蛋白阳性表达多定位在细胞核，其于胆脂瘤组阳性表达率为71.43%（20/28），相比正常外耳道皮肤组10.71%（3/28），明显偏高（P<0.05）。经WB免疫印迹法检测得知，中耳胆脂瘤组P-ERK、P-EGFR与NF-κB的表达量相比正常耳道皮肤组组，表达量均有显著升高（P<0.05）。

3.讨论

EGFR实为一个具有比较明显的酪氨酸蛋白激酶活性，且大小为170kDa的表皮生长因子受体，由三部分组成，即胞内区、跨膜区与胞外区。当胞外部分结合配体后，能形成P-EGFR，将下游信号通路激活，因而可以加速细胞增殖、迁移等[2]。而对于ERK蛋白而言，其实为丝氨酸-苏氨酸激酶亚家族，在相关成员当中，当前研究最多的是ERK2、ERK1。从根本上来讲，在整个Ras/Raf/MEK/ERK信号通路架构当中，ERK1/2为其基础构成，其能够与细胞表面受体转录因子相结合，由细胞浆向细胞核内进行转移，对重要蛋白活性加以控制，最终达到调控细胞周期、凋亡及增殖的目的。对于NF-κB来讲，其作为一种转录因子，提取于B淋巴细胞当中，其能够参与许多基因的调控，还参与免疫反应、炎症反应，对细胞增殖、转化具有调节作用，还能加速肿瘤发展[3]。本文针对中耳胆脂瘤患者，就上述物质在其上皮组织中的表达作一分析，由结果得知，P-EGFR、NF-κB在胆脂瘤组阳性表达率均高于正常外耳道皮肤组。而经WB免疫印迹法检测现实，中耳胆脂瘤组P-ERK、P-EGFR与NF-κB的表达量均高于正常耳道皮肤组。提示P-EGFR、P-ERK与NF-κB的表达在中耳胆脂瘤的形成与发展中，均起到重要作用。

参考文献：

[1]李强，江红群，陈亚琴，等.长链非编码RNA HOTAIR在中耳胆脂瘤中的表达[J].临床耳鼻咽喉头颈外科杂志，2017，31 （4）：250-253.

[2]沈景秋，许昱.中耳炎患者胆脂瘤中转化生长因子α的表达水平的临床意义[J].检验医学与临床，2017，14 （9）：1277-1279.

[3]郝艳，李珂，王建亭，等.NF-κBP65和caspase-3在中耳胆脂瘤中的表达及其临床意义[J].山西医科大学学报，2016，42 （4）：288-291.