木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶对牛肉的嫩化效果研究

谢正林 庄炜杰 许俊齐 袁屹 李迪

摘    要：蛋白酶具有水解肌纤维膜和肌原纤维蛋白质作用，故其作为肉类嫩化剂应用广泛，但不同的蛋白酶具有较强的专一性。本文采用化学提取法分别从木瓜及菠萝中提取出木瓜蛋白酶及菠萝蛋白酶，分析其酶活性，并通过对照R1、木瓜蛋白酶处理R2和菠萝蛋白酶处理R3的牛肉样品感官、镜检及剪切力等指标的对比研究了两种酶对牛肉的嫩化效果。结果表明：本试验提取的菠萝蛋白酶活力（8 752.7±3.3 U·g-1）高于木瓜白酶（6 348.0±2.6 U·g-1），二者均具有较好的嫩化效果，牛肉综合感官效果和牛肉纤维断裂程度的镜检结果均表现为菠萝蛋白酶处理R3>木瓜蛋白酶处理R2>对照R1，剪切力则为对照R1>木瓜蛋白酶处理R2>菠萝蛋白酶处理R3。综合说明，本试验提取的菠萝蛋白酶对牛肉的嫩化效果优于木瓜蛋白酶，这与所提取的酶活力结果一致。

关键词：木瓜蛋白酶;菠萝蛋白酶;嫩化;牛肉

中图分类号：TQ925+2;TS251.5+2         文獻标识码：A           DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2019.10.014

Abstract： Proteinase has the functions of hydrolyze sarcolemma and myofibrillar protein， so it was widely used as meat tenderizer， but different proteases have strong specificity. The experiment was conducted to study the tenderizing effects of papain and bromelain on beef by the comparison of sensory， microscopic and shear forces among the beef treatments of control （R1）， papain （R2） and bromelain （R3）， the papain and bromelain were extracted from papaya and pineapple， respectively. The results showed that in this experiment， the activity of bromelain （8 752.7±3.3 U·g-1） was higher than that of papain （6 348.0±2.6 U·g-1）. In the three treatments， the beef sensory scores and the microscopic results of the beef fiber breakage degree showed that R3>R2>R1， while the shear forces were R1>R2>R3. Comprehensively， both the papain and bromelain extracting in the experiment had good tenderizing effects， and the later one was better than the former one， which was consistent with the results of enzyme activity extracted.

Key words： papain; bromelain; tenderization; beef

木瓜蛋白酶（Papain）属于植物来源蛋白酶范畴，提取自番木瓜的根、茎、叶、果实，是一种活性中心含半胱氨酸的半胱氨酰基蛋白酶[1]。菠萝蛋白酶（Bromelain）提取自菠萝果茎、叶、皮，是经精制、提纯、浓缩、酶固定化、冷冻干燥而得到的一种纯天然植物蛋白酶[2]，由6种以上不同分子结构和分子量的水解蛋白酶构成的酶系[3]。经食品药品监督管理局批准，木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶均可用于食品配方和食品加工中。在肉食品加工业中，二者常用来嫩化原料肉[4]，是嫩肉粉的主要成分，可对肉中的弹性蛋白和胶原蛋白进行部分水解，使肉类制品的口感达到嫩而不烂、鲜香味美的效果[5]。

目前，有关肉的嫩化主要有化学试剂嫩化法、腌制法、注射法、合成嫩化剂嫩化法等[6]，这些方法虽能很好地对肉制品进行嫩化但其毒副作用较大，对营养成分的破坏明显，而利用天然水解蛋白酶对原料肉嫩化则具有安全健康的优势[7]。笔者分别从口感、镜检、剪切力及酶活性几方面探究了木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶对牛肉的嫩化效果，为二者在食品工业的生产和应用提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料、试剂与仪器

新鲜木瓜、菠萝、牛肉，硫酸铵，透析袋（截留相对分子质量6 000～12 000），0.1 mol·L-1 pH值7.8的PBS（磷酸缓冲液），1%酪蛋白，激活剂[含25 mmol·L-1半胱氨酸-盐酸盐、1.5 mmol·L-1 EDTA-Na2 （乙二胺四乙酸二钠）]，10%TCA（三氯乙酸）。所用试剂均为化学纯。

冷冻离心机（上海安享科学仪器厂），真空干燥机（上海精宏实验设备有限公司），真空泵（巩义市子华仪器有限公司），分光光度计（上海精密科学仪器有限公司），恒温水浴锅（上海博迅实业有限公式医疗设备），配有WBS（Warner-Bratzler Shear）刀具的相关剪切力测定仪，热电偶测温仪（探头直径小于2 mm）。

1.2 试验方法

1.2.1 酶的提取    主要流程：粗酶提取→盐析纯化→透析纯化→冷冻干燥备用。

主要步骤：称取新鲜木瓜、菠萝各100 g，将其洗净，沥干，粉碎，加入100  mL预冷0.1 mol·L-1 pH值7.8 的PBS溶液，搅拌后用6层纱布过滤，滤液于4  ℃，5  000 r·min-1离心5 min，弃沉淀，即得到酶粗提液。向酶粗提液中添加硫酸铵，使溶液饱和，4 ℃静置20 min，酶蛋白沉淀析出，离心，收集沉淀，加入0.1mol·L-1 pH值7.8 的PBS溶液约50 mL至完全溶解。将溶解液装入3.5 cm×15 cm透析袋用蒸馏水透析，将透析液用滤纸过滤，收集蛋白酶沉淀备用。

1.2.2 酶活力测定    两种酶的活力测定均采用酪蛋白法测定：取所得酶制剂0.15 g，加入0.01 mol·L-1 pH值7.0 的PBS溶液定容至100 mL，过滤，滤液即为工作酶液。取4支试管，1支为空白对照，3支为平行样品，具体操作步骤按照表1完成。

反应结束后，所得滤液过滤，清液于275 nm波长下测定光吸收值。最后酶活结果取3次重复试验的平均值。

1.2.3 两种酶对肉的嫩化及指标测定    （1）感官测定。取3块500 g牛后腿肉，清洗去血污，修整，去除可见脂肪、结缔组织[12]。处理后的牛肉，其中一块不经任何处理视为R1（对照），分别取20 g粉末状木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶，均匀地撒在另外2块肉块上，分别记为R2和R3。腌制60 min后放入水浴锅中85 ℃煮10 min后取出，各处理肉块分别均匀切成100小块。随机选取20位评价人根据表2评判标准判定R2和R3的嫩化效果，并与对照R1进行对比，取均值为最终调查判定结果。

（2）镜检。将相同方法嫩化处理的R1、R2、R3去除表面后切薄片取样置于显微镜下观察，对其纤维断裂情况进行对比。

（3）剪切力测定。剪切力的测定参考NY/T1180-2006[8]，取肉样（6 cm×3 cm×3 cm），剔除肉表面的筋、腱、膜及脂肪。放入预加热到80 ℃的恒温水浴锅中加热，当肉样的中央温度达75 ℃的时，将肉样取出立即冷却至中心温度为2～6 ℃。用半径为0.6 cm的圆形取样器在距离肉样边缘6 mm内钻切肉样（沿与肌纤维平行钻切），孔样深度大于2.5 cm，每个孔样间距不小于6 mm，选取标准平行肉样3个。把孔样放置在测定仪的刀槽上，使刀口与肌纤维垂直。测得数据中，刀片切割过程中的最大剪切力值（峰值）就是孔样剪切力值。记录所有的测定数据，取各个孔样剪切力测定值的平均值扣除空载运行最大剪切力，计算肉样的嫩度值（X）。计算公式：

2 结果与分析

2.1 木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶酶活力

经检测，菠萝蛋白酶的平均酶活力（8  752.7±3.3  U·g-1）显著高于木瓜白酶（6 348.0±2.6 U·g-1）（P<0.05）。

2.2 感官对比

对照R1肉呈红色，有光泽，脂肪均匀呈淡白黄色，表面干燥微粘手，新切面湿润，指压后凹陷恢复较慢，肉味正常，煮沸后的肉汤透明澄清;R2肉呈红色，有光泽，表面干燥微粘手，指压后凹陷恢复略快，肉味正常，煮沸后的肉汤透明澄清;R3肉呈红色，有光泽，脂肪均匀呈淡白黄色，表面干燥粘手，新切面湿润，指压后凹陷恢复较快，肉味较佳，煮沸后的肉汤透明澄清，脂肪团聚于表面具有香味。由表3可知，R1、R2和R3的牛肉色泽保持一致，而牛肉粘度、弹性及煮沸后的肉汤评分均表现为R3>R2>R1，气味表现为R3略高于R1和R2。

2.3 镜检对比

由图1可以看出，与对照R1相比较，经过两种酶处理的牛肉样品R2和R3，肌纤维开始断裂，原有的韧性组织逐渐失去，其中菠萝蛋白酶处理R3牛肉肌细胞排列凌乱无序，较木瓜蛋白酶处理R2肌纤维中断裂片段明显增加。

2.4 剪切力对比

由图2可以看出，经菠萝蛋白酶处理R3肉样的平均剪切力最小为27.3 N，其次是经木瓜蛋白酶处理R2肉样，其平均剪切力为30.4 N，而对照R1肉样平均剪切力最大，为35.1N，3组处理之间差异显著（P<0.05）。分析原因在于，酶将肉中的结缔组织及肌纤维中结构较复杂的胶原蛋白、弹性蛋白进行适当降解，使得牛肉结构中的某些连接键发生断裂，从而大大降低了牛肉的平均剪切力;而两种酶对牛肉中蛋白质的降解及连接键断裂程度不同，故R2和R3的平均剪切力也不同，其中后者低于前者，说明菠萝蛋白酶对蛋白质的降解程度更高，即菠萝蛋白酶对牛肉的嫩化效果优于木瓜蛋白酶嫩化效果。

3 结论与讨论

肉品嫩度是消费者评判肉质优劣最常用的指标。肉的嫩化方法有物理、化学和生物法，生物法中由植物中提取的酶类主要有木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶等，此类酶对结缔组织有较强的分解作用，嫩化效果十分显著，其中木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶是目前商品酶类的主要种类[9]。

本试验中，不同处理牛肉综合感官效果表现为菠萝蛋白酶处理R3>木瓜蛋白酶处理R2>对照R1，剪切力表现为R1>木瓜蛋白酶处理R2>菠萝蛋白酶处理R3（剪切力越小其嫩化效果越好），镜检结果表现为菠萝蛋白酶处理R3牛肉纤维断裂程度高于木瓜蛋白酶处理R2，二者均高于对照R1。综合说明木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶均具有较好的嫩化效果，且后者效果优于前者，这应该主要受二者酶活性亦表现为后者显著高于前者所致。此外，两种酶的作用机制不同，木瓜蛋白酶主要是消化纤维，嫩化后的牛肉有塌陷，而菠萝蛋白酶主要作用表现为纤维断裂，此结论与关国雄等[10]研究结果一致。

参考文献：

[1]常慧敏，杨敬东，田少君.超声辅助木瓜蛋白酶改性对米糠蛋白溶解性和乳化性的影响[J].中国油脂，2019，44（4）：35-40.

[2]唐梅，勞斌基，林远敢，等.响应面法优化超滤提取菠萝蛋白酶工艺条件[J].食品研究与开发，2016，37（7）：56-61.

[3]田欣，张艺凡.菠萝蛋白酶的提取及应用[J].食品安全导刊，2017（33）：121.

[4]韦朝英.木瓜蛋白酶提取及在食品工业中的应用[J].农业与技术，2018，38（15）：71-72.

[5]李培红，王怀欣，郇延军.木瓜蛋白酶对猪肉脯嫩化效果的研究[J].肉类研究，2011，25（1）：40-45.

[6]方焕，生吉萍，吴显荣.工业生产中木瓜蛋白酶的活性检测方法比较[J].食品与机械，2000（6）：27-29.

[7]王攀，范娜.木瓜蛋白酶酶解核桃饼粕制备抗氧化多肽的研究[J].江苏农业科学，2019，47（11）：238-241.

[8]中华人民共和国农业部. NY/T 1180-2006 肉嫩度的测定 剪切力测定法[S].北京：中国农业出版社，2006.

[9]熊华.木瓜蛋白酶应用研究进展[J].保鲜与加工，2006（1）：7-8.

[10]关国雄，颜子颖，林哲甫.弹性蛋白酶和木瓜蛋白酶对不同蛋白质水解能力的比较[J].食品科学，1992（3）：4-6.