植原体对冬枣根部可培养内生细菌菌群的影响

陈有忠 邱志伟 于奥安 朱伟垚 杨俊林 陈招荣

摘    要：枣疯病是枣树上由植原体引起的一种毁灭性病害，但有关枣疯病植原体与寄主根部内生细菌间的相关性鲜有研究。本试验采用常规分离培养方法从春季冬枣根部分离纯化内生细菌，通过PCR扩增出内生细菌16S rRNA基因的DNA片段，测序后利用NCBI中的BLAST软件进行序列同源性比对，对健康和感病冬枣树根部可培养内生细菌进行统计，根据二者对比结果初步判断植原体对冬枣根部可培养内生细菌菌群的影响。结果表明，健康冬枣树分离出18个菌株，鉴定出6个属（除2个仅鉴定到科水平外）的内生细菌，包括芽孢杆菌属（Bacillus）6株、假单胞菌属（Pseudomonas）5株、寡养单胞菌属（Stenotrophomonas）2株、金黄杆菌属（Chryseobacterium）1株、志贺氏菌属（Shigella）1株、埃希氏菌属（Escherichia）1株;感病冬枣树分离出17个菌株，鉴定出2个属的内生细菌，分别为芽孢杆菌属（Bacillus）10株和假单胞菌属（Pseudomonas）7株;感病冬枣树根部可培养内生细菌菌群属水平较健康冬枣树减少4个属，说明枣疯病导致冬枣根部内生细菌菌群在属水平上的降低。

关键词：枣疯病;内生细菌;16S rRNA基因

中图分类号：S665.1;S436.6                文献标识码：A                DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2019.10.003

Abstract： Jujube Witches Broom（JWB） is a devastating disease caused by phytoplasma in jujube trees. There are few studies on the correlation between the phytoplasma and endophytic bacteria in the host root. In this study， endogenous bacteria were isolated and purified from Chinese winter jujube roots by conventional culture method in spring， the DNA fragments of endogenous bacteria 16S rRNA gene were amplified by PCR， and then the BLAST software in NCBI was used to search the sequencing results for sequence homology alignment. The effects of phytoplasma on the endophytic bacteria of Chinese winter jujube were analyzed through the comparison between the roots of healthy and infected. The results showed that 18 strains were isolated from the healthy Chinese winter jujube， which were identified to six genera except for 2 strains identified to the family level， including Bacillus（6 strains）， Pseudomonas（5 strains）， Stenotrophomonas（2 strains）， Chryseobacterium（1 strain）， Shigella（1 strain）， and Escherichia（1 strain）. 17 strains were isolated from the JWB infected Chinese winter jujube， which were identified to two genera， including Bacillus（10 strains） and Pseudomonas（7 strains）.The endophytic bacteria in root of infected Chinese winter jujube were 4 genera less than that of the healthy Chinese winter jujube， indicating that the endophytic bacteria in the root of infected Chinese winter jujube was decreased by the disease of JWB.

Key words： Jujube Witches Broom; endophytic bacteria; 16S rRNA gene

棗（Ziziphus jujube Mill）是鼠李科枣属植物，属于温带落叶小乔木，生长于海拔1 700 m以下的山区、丘陵或平原，适应性强、种植范围广，是我国特色优势果树和第一大干果树种，在我国农业经济中具有重要地位。据记载，我国枣树的种植栽培已有3千～4千年的历史，枣树资源丰富，品种优良[1]。枣疯病是一种由植原体引起的高致死传染性病害，几乎分布于国内外所有枣树分布区，且绝大多数早熟品种对其敏感，枣树一旦染病，通常幼树1～2年、成龄树3～5年即逐渐枯死，早在1951年，我国很多地区就发现有枣疯病危害，现仍是枣业发展的一大障碍[2]。植原体最早是在桑树萎缩病等病株的筛管切片中发现，经相关学者系统地比较研究，确定了枣疯病是由植原体感染引起，而不是病毒或病毒与植原体复合侵染所造成的结果，而关于植原体引起黄化的作用机制主要是其在筛管细胞中大量增殖引起阻塞所致[3-4]。刘栋等[5]通过对发病叶片组织结构比较分析，结果揭示了枣疯病发病后叶片的细胞结构发生变化，如细胞数量减少、排列紊乱，甚至某些特殊结构缺失等。

枣疯病防治相关研究主要集中在抗枣疯病新品种品系的选育、药物治疗等方法，但新品种需要较长时间，而且抗病性易被克服，药物治疗持续时间短，易复发[6-7]。植物内生菌（Endophyte）是植物组织内的正常菌群，也是植物微生态系统中的天然组成成分，不仅包括互惠共利和中性的内共生微生物，而且包括潜伏在宿主体内的病原微生物[8]。作为一种新的生物资源，植物内生菌可通过多种途径抑制病原菌生长，达到防治病害的目的，例如产生抗生素类、水解酶类、植物生长调节剂和生物碱类物质，与病原菌竞争营养物质，增强宿主植物的抵抗力以及诱导植物产生系统抗性等，故可用于防治植物病害，尤其是化学防治较为困难的植物病害[9-10]。但目前尚未有关于枣疯病植原体与寄主根部内生细菌间相关性研究，鲜有针对于枣疯病植原体生物防治方面的研究。

本课题组前期研究发现春季枣疯病植原体主要从根部组织通过维管束组织进入植株上部幼嫩组织如幼芽和叶片中[5]。根部是植原体主要过冬场所，因此，本研究采集健康及染枣疯病的冬枣树根部组织，对内生细菌进行分离、纯化、培养及形态和分子鉴定，研究健康及染枣疯病的冬枣树根部内生菌种类多样性，为冬枣病害防治提供研究基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验材料取自天津农学院东校区枣园，在同地块中选取健康冬枣树和感染枣疯病冬枣树，每3株植株根部组织合并为1个样品，分别将健康冬枣树（Z）和感染枣疯病冬枣树（B）的根部清洗干净，置于4 ℃冰箱内保存备用。

1.2 试验方法

1.2.1 内生细菌的分离纯化    先将健康和感染枣疯病的冬枣树根部组织用自来水清洗，去除表面的泥土，用滤纸吸干或晾干残留的水分后，用天平分别称取0.2 g根部组织。在超净工作台下，将根部完全浸泡在75%的乙醇溶液10 min，再用无菌水洗3～4次，将最后1次清洗的水涂布在LB平板上用来检查灭菌的效果。将表面消毒干净的根部组织用灭过菌的剪刀剪碎置于无菌研钵中，加入1 mL无菌水充分研磨。将研磨液转移至无菌试管中，1 000 r·min-1离心1 min去除大部分根部组织，取上清液进行梯度稀释10-1～10-3，每个梯度取100 μL涂布在LB固体培养基上培养，每个处理重复3次，置于28 ℃恒温培养箱中倒置培养，每天定时观察菌落的生长状况。

待内生菌长出后，根据菌落的形态特征分别挑取不同类形的内生细菌，在LB固体培养基中用平板划线法反复纯化，直到在平板表面长出单菌落后，4 ℃冰箱保存备用。

1.2.2 革兰氏染色    为更好地观察内生细菌的菌体形态，对内生细菌进行革兰氏染色[11]，通过镜检对分离出的内生细菌进行初步分类鉴定。

1.2.3 内生细菌DNA的提取    在超净工作台下，在酒精灯5 cm附近将液体LB培养基倒入无菌试管中，用无菌接种针挑取内生细菌的单菌落放于试管中，放置于33 ℃的摇床（200 r·min-1）摇培10 h。用Easy Pure Bacteria Genomic DNA Kit试剂盒提取DNA。将最后洗脱的DNA置于-20 ℃冰箱保存备用。

1.2.4 PCR扩增16S  rRNA的DNA片段    以冬枣树根部组织分离出内生细菌的DNA为模板进行PCR扩增。

引物序列为：27F（5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3）

1 492R（5-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3）

PCR反應扩增体系见表1。

PCR扩增程序见图1。

PCR反应结束后，取3 μL PCR产物与1 μL 6×DNA Loading Buffer混合后加入1.0%琼脂糖凝胶点样电泳。待DNA跑至凝胶中央时结束电泳，Goldview染色剂染色10 min，使用凝胶成像系统观测电泳条带并摄影记录。

将PCR获得的产物送至华大基因公司测序，将所得的各个菌株的基因序列测序结果在NCBI （https：//www.ncbi.nlm. nih.gov/）数据库中进行BLAST比对，筛选出与其同源性最高的已知序列，根据Clarridge[12]提出的16S rRNA基因序列同源性高于99%可确定种，同源性在95%～99%之间可确定属的原则，初步确定所测菌株的分类地位。

2 结果与分析

2.1 内生细菌的分离结果

观察健康和染病冬枣树分离出的内生细菌（图2）可以发现，在涂布了健康和染病冬枣树菌液的培养皿上，均长出了大量细菌菌落，说明冬枣树的根部组织存在着丰富的内生细菌;从健康冬枣树和染病冬枣树根部组织分离出来的内生细菌菌落形态看，健康冬枣树比染病冬枣树分离出来的内生细菌的丰富度要大;分离得到的内生细菌根据形态差异进行平板划线纯化，各内生菌菌株生长速度和菌落形态存在差异，经过形态学鉴定和再分离纯化，最终获得正常冬枣树内生细菌18个菌株（Z1～Z18号），染病冬枣树内生细菌17个菌株（B1～B17号）。

2.2 革兰氏染色结果

将分离得到的内生细菌进行了革兰氏染色，对内生细菌进行初步分类鉴定，其中紫色为阳性菌，红色为阴性菌。由革兰氏染色结果（表2）可知，革兰氏阳性菌共有16个菌株，革兰氏阴性菌共有19个菌株;健康植株根部内生细菌菌株中12株为革兰氏阴性菌，6株为革兰氏阳性菌，而发病植株根部内生细菌菌株中7株为革兰氏阴性菌，10株为革兰氏阳性菌。

2.3 细菌16S rRNA基因扩增结果

将分离出来的内生细菌的DNA作为模板，引物以27 F/1 492 R进行PCR扩增，经1.0%的琼脂糖凝胶上点样电泳。结果（图3、图4）显示，健康冬枣树和染病冬枣树都跑出了约为1 500 bp左右的目的条带，说明PCR扩增出了内生细菌的16S rRNA基因的DNA片段。

2.4 内生菌检测结果

经测序得到35个菌株16S rRNA基因的DNA片段序列，经过序列同源性比对，结果（表3和表4）。

由表3可以看出，健康冬枣树根部组织内生菌分属于6个属，菌株Z1为金黄杆菌属（Chryseobacterium，革兰氏阴性菌），序列相似度为98%;菌株Z2的16S rRNA基因片段序列与比对序列相似度为99%，可以确定其为埃希氏菌属（Escherichia，革兰氏阴性菌）成员;菌株Z4、Z14、Z15、Z16、Z17和Z18的16S rRNA基因片段序列与比对序列相似度在97%～99%之间，可以确定这些菌株属于芽孢杆菌属（Bacillus，革兰氏阳性菌）;菌株Z6的16S rRNA基因片段序列与比对序列相似度为99%，可以确定该菌株为志贺氏菌属（Shigella，革兰氏阴性菌）成员;菌株Z7、Z8、Z9、Z10、Z11的16S rRNA基因片段序列与比对序列相似度在97%～99%之间，可以确定这些菌株属于假单胞菌属（Pseudomonas，革兰氏阴性菌）;菌株Z12和Z13的16S rRNA基因片段序列与比对序列相似度为99%，可以确定其均为寡养单胞菌属（Stenotrophomonas，革兰氏阴性菌）成员;此外，菌株Z3和Z5的16S rRNA基因片段序列与比对序列相似度均小于95%，初步确定其为肠杆菌科（Enterobacteriaceae，革兰氏阴性菌）成员，无法准确确定其属水平的分类地位。

由表4可以看出，感病冬枣树根部组织内生菌分属于假单胞菌属和芽孢杆菌属，相似度均≥99%，较健康冬枣树根部组织内生细菌减少4个属的物种。

3 结论与讨论

植物内生菌因植物种类不同存在差异，蓝江林等[13]从不同来源地的茄子植株中分离到芽孢杆菌属、假单胞菌属、肠杆菌属（Enterobacter）、微杆菌属 （Microbacterium）、耶尔森菌属（Yersinia）等18属的细菌;Cui等[14]对不同来源、不同枣品种以及不同部位的内生细菌进行的分离纯化，分析其分类地位，得到了芽孢杆菌属、假单胞菌属、节杆菌属（Arthrobacterium）、湿斯捷连科属（Nesterenkonia）、寡养单胞菌属、土地杆菌（Pedobacter）等共13个属，16个种内生细菌，并发现根部内生细菌菌群数量和种类丰度都高于其他组织中的内生细菌，而且样品品种和采集地区因素也对枣内生细菌菌群有明显的影响;秦晓婧等[15]从冬枣果肉组织中分离得到了4株芽孢杆菌内生细菌菌株。

本试验从感染枣疯病植株和健康植株的冬枣根部组织分别分离得到17和18株内生细菌，其中健康冬枣树根部组织内生菌分属于6个属，即芽孢杆菌属、假单胞菌属、志贺氏菌属、寡养单胞菌属、金黄杆菌属、埃希氏菌属，而感病冬枣树根部组织内生菌分属于芽孢杆菌属和假单胞菌属2个属，较健康冬枣树根部组织内生细菌减少4个属的物种，说明感病植株使冬枣树根部内生细菌属水平的种类减少，应该与植原体在枣树根部大量繁殖有关。Eichmeier等[16]通过高通量测序技术明确了植原体侵染对核果类植物的韧皮部内生细菌菌群在种类丰度和数量方面都产生一定的影响。

本研究中分离得到的内生细菌在属水平上较Cui等[14]少，这应该与样品品种以及枣树生长环境不同有关。但芽孢杆菌属、假单胞菌属在所分离的内生细菌中占比均较高，芽孢杆菌易于在田间定殖，能够产生脂胎类、聚酮类以及抗菌蛋白等抑菌物质，因此芽孢桿菌属成员被广泛地应用于生产中病害生物防治[17]。蔡丽等[18]从凤凰单丛茶分离筛选出具有抑菌活性的甲基营养型芽孢杆菌，对梨果多种病原菌物具有较强的抑制作用;张晓丽等[19]在番茄植株内部分离得到一株对番茄灰霉病病原菌具有较高拮抗效果且耐高温高盐、耐储藏的内生细菌JZ3，而这株内生菌经鉴定为解淀粉芽孢杆菌;Lang[20]等从冬枣中分离得到3株对枣缩果病有一定抑制作用的内生枯草芽孢杆菌。本试验也分离出了芽孢杆菌属，那么芽孢杆菌属的物种是否有可能影响植原体的生长，从而影响植物体内内生菌的多样性，能否作为枣疯病的生防菌还需要进一步验证。

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