气调包装酱卤鸭食管冷藏期间理化指标变化及优势腐败菌的分离鉴定

李德红 祝传海 岳晓霞 王璇 吕云雄 刘俊杞 张根生

摘 要：为研究气调包装酱卤鸭食管冷藏条件下贮藏品质的变化，将未加抑菌剂的气调包装酱卤鸭食管在冷藏（0～4 ℃）条件下贮存12 d，分别测定其pH值、水分活度、硫代巴比妥酸反应物（thiobarbituric acid reactive substance，TBARs）值、感官评分及微生物菌相等指标的变化。结果表明：随着冷藏时间的延长，气调包装酱卤鸭食管的感官品质显著降低、pH值显著下降，而TBARs值呈显著上升趋势，水分活度呈下降趋势，但下降幅度很小;将分离纯化后的腐败菌采用16S rDNA测序方法进行鉴定，发现冷藏条件下气调包装酱卤鸭食管中的优势腐败菌主要有副黄假单胞菌、特基拉芽孢杆菌、肉芽肿克雷伯氏菌和香坊肠杆菌。

关键词：气调包装;酱卤鸭食管;理化指标;优势腐败菌

Abstract： In order to study the quality changes of modified atmosphere-packaged （MPA） sauced duck esophagus under cold storage conditions， MPA sauced duck esophagus without any antimicrobial was stored under refrigeration （0–4 ℃） for 12 days. Changes in pH value， water activity， thiobarbituric acid reactive substance （TBARs） value， sensory evaluation score and microbial flora were determined during the storage period. The results showed that with the prolongation of storage time， the sensory quality of MPA duck esophagus decreased significantly， and so did the pH value. In addition， the TBARs value showed a significant upward trend， while the water activity decreased but only slightly. The dominant spoilage bacteria in MPA sauced duck esophagus were Pseudomonas parafulva， Bacillus tequilensis and Klebsiella granulomatis and Enterobacter xiangfangensis， as identified by 16S rDNA sequencing.

Keywords： modified atmosphere packaging; sauced duck esophagus; physicochemical indicators; dominant spoilage bacteria

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190626-149

中圖分类号：TS251.1                                     文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2019）09-0059-05

引文格式：

李德红， 岳晓霞， 张根生， 等. 气调包装酱卤鸭食管冷藏期间理化指标变化及优势腐败菌的分离鉴定[J]. 肉类研究， 2019， 33（9）： 59-63. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190626-149.    http：//www.rlyj.net.cn

LI Dehong， YUE Xiaoxia， ZHANG Gensheng， et al. Sauced duck esophagus： changes in physicochemical indexes during cold storage in modified atmosphere packaging and isolation and identification of dominant spoilage bacteria[J]. Meat Research， 2019， 33（9）： 59-63. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190626-149.    http：//www.rlyj.net.cn

鸭食管又名鸭郡把、鸭胰胃，位于鸭胗和鸭食带连接的位置，其风味独特、营养价值高，深受我国消费者的喜爱，是我国传统食材之一[1-2]。酱卤鸭食管属于低温肉制品，一般为散卖，这制约了其贮藏期间的品质和货架期稳定性[3]。目前针对酱卤鸭肉制品的研究主要集中在工艺参数优化和贮藏品质研究[4-5]，对于其优势腐败菌的分离鉴定方面的研究尚需完善，尤其是对于酱卤鸭食管的研究鲜有报道。

气调包装是指通过调节食品包装环境气体的构成来延长食品寿命和货架期的一种食品包装技术[6-7]。气调保鲜技术在果蔬保鲜中的应用比较广泛，但现在也开始应用于肉类、水产品及焙烤食品等方便食品保鲜[8]。气调保鲜肉类产品有较长的保鲜期和货架期，较好地保持了肉类原有的品质、色泽、风味、口感及营养，提升了肉类产品的食用价值。

在不同温度条件下，食品的理化指标和菌相结构随贮藏时间的延长均会发生很大变化。李鸣等[9]研究不同贮藏温度对气调包装白切鸡pH值、色度、贮藏损失等理化指标以及微生物指标的影响，结果表明，4 ℃冷藏能有效延长该产品的货架期。刘子宇等[10]采用基础培养基及多种选择性培养基，分离筛选和初步鉴定普通冷却猪肉中的主要微生物菌群，结果表明，可能引起冷却猪肉腐败的微生物主要包括李斯特氏菌属、肠杆菌科、假单孢菌属、乳酸菌属（主要是乳酸球菌）及热杀索丝菌属。

本研究主要对冷藏期间气调包装酱卤鸭食管的理化指标变化及优势腐败菌的分离鉴定进行研究，为气调包装酱卤鸭食管保鲜提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

碘乙酸钠（分析纯） 西陇化工股份有限公司;氯化钾（分析纯） 天津市大陆化学试剂厂;三氯乙酸（分析纯） 天津欧博凯化工有限公司;硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）（分析纯） 天津市新精细化工开发中心。

1.2 仪器与设备

TG16-WS高速离心机 黑龙江嘉禾广博进出口有限公司;CS-800色差仪 杭州彩谱科技有限公司;V-5000分光光度计 上海元析仪器有限公司;DHP-9082恒温培养箱 上海百典仪器设备有限公司;HBD5-MS2123Wa水分活度测试仪 北京金洋万达科技有限公司;LDZX-50FBS立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂;AV-608全自动复合气调包装机 苏州德森包装机械有限公司;Sartorious-PB-10 pH计 广州市深华生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 气调包装酱卤鸭食管的制作

原料经过焯水至断生后用老汤卤煮1 h，卤煮后的鸭食管在冷却室（4 ℃）冷却，切割成5～6 cm后装盒，经气调包装后，于冷藏（0～4 ℃）条件下贮存12 d。气调包装条件为75%氮气+25%二氧化碳。

1.3.2 pH值测定

参照GB/T 9695.5—2008《肉与肉制品 pH测定》[11]，并稍作改动。称取10 g酱卤鸭食管肉样，将其剪碎，加入90 mL pH值测定液（5 mmol/L碘乙酸钠与0.15 mol/L氯化钾混合液）摇匀，在室温条件下用校准后的pH计进行测定[12]。

1.3.3 水分活度测定

参照GB 5009.238—2016《食品安全国家标准 食品水分活度的测定》[13]。

1.3.4 硫代巴比妥酸反应物（thiobarbituric acid reactive substance，TBARs）值测定取10 g剪碎后的酱卤鸭食管，加入25 mL 25%三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA），再加入20 mL蒸馏水，高速均质30 s，3 000 r/min离心20 min后用滤纸过滤;取上清液2 mL，加入2 mL 0.02 mo1/L TBA，沸水浴20 min，流水冷却5 min后在532 nm波长处测定吸光度;取25 mL 25% TCA，加入20 mL蒸馏水，取混合液2 mL再加入2 mL TBA作为空白对照[14-15]。

1.3.5 感官評定

采用定量描述性分析方法对酱卤鸭食管进行感官评定。采用9 cm线性尺度为评分标尺，10 名品评员参照GB/T 22210—2008《肉与肉制品感官评定规范》[16]和姚来斌等[17]方法中的感官评分要求对样品的色泽、口感、气味、风味、组织状态及总体可接受度进行评分。最高分为9 分，最低分为1 分。酱卤鸭食管的感官评价标准见表1。

1.3.6 菌落总数测定

参照GB 4789.2—2010《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》[18]。

1.3.7 气调包装酱卤鸭食管中优势腐败菌的分离鉴定

将介于腐败和未腐败临界点之间的气调包装酱卤鸭食管按菌落总数测定方法进行梯度稀释，选择3 个合适的稀释度，倾注于各培养基，每个稀释度重复5 次，30 ℃培养72 h，选取菌落总数30～300 个的平板[19]。通过菌落形态特征观察和生理生化实验，进行菌株的筛选分组，挑取单菌落进行斜面培养、编号，然后采用不同的培养基平板进行纯化。得到的纯种菌株制成甘油菌悬液，于-80 ℃超低温冰箱中保藏。

将超低温保藏的菌株进行活化，并用酚/氯仿抽提法提取其基因组DNA[20]，采用通用引物27F（5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3）和1492R（5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3）进行16S rRNA的聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增。PCR反应体系总体积25 ?L，包括DNA模板2.0 ?L、正反向引物各0.6 ?L（0.2 ?mol/L）、Taq酶1 ?L、脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）1.6 ?L、Mg2+ 1.5 ?L，加重蒸水至25 ?L。PCR扩增参数设置为：94 ℃预变性4 min后，按照94 ℃变性1 min、55 ℃退火1 min、72 ℃延伸1 min进行28 个循环，最后于72 ℃延伸10 min。PCR产物经过1%琼脂糖凝胶电泳检测符合测序要求，对扩增产物进行测序。将获得的序列在Ez Taxon server 2.1软件中进行比对分析，获得初步鉴定结果。用MEGA 6.0软件进行系统进化树构建，从而获得菌群结构和功能信息[21]。

1.4 数据处理

所得数据均为3 次实验的平均值，使用Statistix 7.0软件中的Linear Models程序进行数据统计分析，使用单因素方差分析进行数据差异显著性分析（P<0.05），利用Origin 8.0软件（美国Microcal公司）绘制折线图。

2 结果与分析

2.1 气调包装酱卤鸭食管冷藏过程中pH值的变化小写字母不同，表示差异显著（P<0.05）。下同。

由图1可知：在冷藏条件下，气调包装酱卤鸭食管pH值呈显著下降趋势（P<0.05），变化范围为5.8～6.0，且下降趋势较平缓;冷藏10 d时，酱卤鸭食管pH值大幅降低，结合感官评价得到，产品品质急剧下降;冷藏初期，酱卤鸭食管的pH值为5.99，冷藏末期降为5.81。结合酱卤鸭食管中优势腐败菌分离鉴定结果及包装环境分析，其pH值下降可能是微生物发酵糖类或包装内的CO2溶解在鸭食管内形成碳酸类物质产酸造成的[22-23]。

2.2 气调包装酱卤鸭食管冷藏过程中水分活度的变化

由圖2可知：气调包装酱卤鸭食管的初始水分活度接近1.000，水分活度大于0.9非常有利于微生物的生长繁殖;随着冷藏时间的延长，酱卤鸭食管会由于氧化析出一部分水分[24]，但是由于酱卤鸭食管的冷藏环境是无氧且低温的，因此其水分活度呈下降趋势（P<0.05），但下降幅度较小，在12 d的冷藏期内，其水分活度始终处于0.980～1.000之间。

2.3 气调包装酱卤鸭食管冷藏过程中TBARs值的变化

由图3可知：随着冷藏时间的延长，气调包装酱卤鸭食管TBARs值呈上升趋势，且差异显著（P<0.05）;气调包装酱卤鸭食管初始TBARs值约为0.1 mg/kg，贮藏末期为0.4 mg/kg左右，虽然没超过0.5 mg/kg，未能使脂肪出现哈喇味，但也表明产品脂肪在贮藏过程中发生了氧化。

2.4 气调包装酱卤鸭食管冷藏过程中感官品质的变化

由图4可知，冷藏1～7 d时，气调包装酱卤鸭食管的感官评分呈下降趋势，贮藏时前期的感官品质下降较缓慢，随着冷藏时间的延长，气调包装酱卤鸭食管的感官品质一直比较稳定，但是由于产品水分及蛋白质含量较高，贮藏后期由于蛋白质变质及微生物繁殖产酸导致产品出现令人不愉快的酸臭味[25-26]，产品表面也有发黏渗水现象发生。到冷藏第7天时，产品的感官品质已经表明其不适合食用。

2.5 气调包装酱卤鸭食管冷藏过程中菌落总数的变化

由图5可知：气调包装酱卤鸭食管的初始（冷藏1 d）菌落总数为2.6 （lg（CFU/g）），在冷藏条件下，随贮藏时间的延长呈快速增长趋势;贮藏末期，产品的菌落总数为5.25 （lg（CFU/g））左右，已经大大超过GB 2726—2016《食品安全国家标准 熟肉制品》[27]中酱卤肉制品菌落总数不得超过80 000 CFU/g的标准。

2.6 气调包装酱卤鸭食管冷藏过程中优势腐败菌的鉴定结果

经过一系列的分离、纯化、筛选，共分离出69 株菌。由表2可知，经过菌落形态、菌株形态以及相关指标分析，将69 株菌共分为4 类菌群，其中菌株1占41%、菌株2占25%、菌株3占22%、菌株4占12%。

由图6可知：菌株1与香坊肠杆菌（Enterobacter xiangfangensis）的同源性最高，相似度为99.70%;菌株2与特基拉芽孢杆菌（Bacillus tequilensis）的同源性最高，相似度为99.85%;菌株3与副黄假单胞菌（Pseudomonas parafulva）的同源性最高，相似度为100.00%;菌株4与肉芽肿克雷伯氏菌（Klebsiella granulomatis）的同源性最高，相似度为99.68%。肠杆菌属、芽孢杆菌属及假单胞菌属的微生物是食品中比较常见的腐败微生物，在冷藏条件下仍然比较活跃，繁殖能力较强[28]。克雷伯氏菌属的微生物是禽类中较为常见的微生物[29]。鸭食管在生产过程中要进行烫漂、卤煮等过程，经过冷藏，克雷伯氏菌仍然会有残留。叶可萍等[30]在研究气调包装酱卤鸭翅中得到的优势腐败菌主要有嗜冷杆菌，这是由于检测部位、原材料及生产工艺的不同，导致检测结果有所差异。香坊肠杆菌、特基拉芽孢杆菌、副黄假单胞菌以及肉芽肿克雷伯氏菌在繁殖过程中均会有不同程度的产酸、产气生物反应，结合酱卤鸭食管冷藏后期会出现发酸、发黏、涨盒的情况，表明分离鉴定出的这几种微生物是导致气调包装酱卤鸭食管冷藏条件下发生腐败变质的优势腐败菌。

3 结 论

在冷藏条件下，气调包装酱卤鸭食管中较高的水分含量和丰富的营养物质导致其在贮藏过程中极易发生腐败变质。气调包装采用的是密封性较好的材料，填充气体为75%氮气+25%二氧化碳，对食品中的好氧菌有较好的抑制作用。从pH值、感官特性等方面判断，在贮藏过程中气调包装酱卤鸭食管的品质变化是缓慢的，且在冷藏第8天时已完全不能食用。经分离鉴定得到，特基拉芽孢杆菌、香坊肠杆菌、肉芽肿克雷伯氏菌和副黄假单胞菌是气调包装酱卤鸭食管中的主要腐败菌。本研究结果对今后研究气调包装酱卤鸭食管防腐工艺中抑菌剂及灭菌工艺的选择均有参考意义。

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