矮膜苞芹药材鉴定及含量测定研究

胡江兰 王素芳 朱金芳 帕尔哈提·多力坤 罗蒙

摘要：目的  建立矮膜苞芹药材的鉴定及含量测定方法，为塔什库尔干矮膜苞芹药材质量标准建立与资源开发利用提供依据。方法  对10批矮膜苞芹的药材性状、显微特征进行观察描述;参照2015年版《中华人民共和国药典》方法对矮膜苞芹的水分、灰分、浸出物、挥发油进行测定;以木犀草素为对照品，建立矮膜苞芹的薄层鉴别方法及反相高效液相色谱含量测定方法。结果  对矮膜苞芹的药材性状和显微特征进行了描述;薄層色谱斑点清晰、无拖尾，特征性强;检查项中初步拟定水分不得过8%，总灰分不得过15%，酸不溶性灰分不得过4%，水溶性浸出物不得少于24%，醇溶性浸出物不得少于13%，挥发油不得少于1.5%;建立了矮膜苞芹中木犀草素的含量测定方法，并根据测定结果暂定本品含木犀草素不得少于0.3 mg/g。结论  本研究建立的方法操作简便，准确性、重复性好，稳定可靠，可用于控制矮膜苞芹药材的质量。

关键词：矮膜苞芹;鉴定;木犀草素;含量测定

中图分类号：R284.1    文献标识码：A    文章编号：1005-5304（2019）10-0066-04

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.10.015      开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Abstract： Objective To establish the identification and content determination method for Hymenoleana nana medicinal herbs; To provide a scientific basis for the establishment of quality standards and resource development and utilization of the medicinal herbs in Tashkurgan. Methods The medicinal properties and microscopic characteristics of 10 batches of Hymenoleana nana were observed and described. The water， ash， leachate and volatile oil of Hymenoleana nana were determined according to Pharmacopoeia of China， 2015 edition. The TLC method and RP-HPLC of Hymenoleana nana were established with luteolin as reference substance. Results The medicinal properties and microscopic characteristics of Hymenoleana nana were described. The TLC were clear and without tailing， and the characteristics were strong. The limit for moisture， total ash and acid-insoluble ash was no more than 8%， 15%， 4%， water-soluble leaching materials， soluble extract， and volatile oil was no less than 24%， 13%， and 1.5%， respectively. The determination method of the content of luteolin in the Hymenoleana nana was established， and the results of the determination were tentatively determined that the product contains luteolin no less than 0.3 mg/g. Conclusion The established method is simple， accurate， reproducible， stable and reliable， which can be used to control the quality of Hymenoleana nana.

Keywords： Hymenoleana nana; identification; luteolin; content determination

矮膜苞芹Hymenoleana nana Rupr.俗名库鲁木提，为伞形科棱子芹属高山膜苞芹亚属多年生草本植物，主产于新疆塔什库尔干。目前国内对矮膜苞芹研究较少且大多为药理研究，如降血压[1]、降血糖[2]等。有文献报道采用HPLC对矮膜苞芹中木犀草素和柚皮苷含量进行测定[3]，《新疆植物志》仅有对其原植物性状的描述[4]，未见关于其质量控制方面的研究。本研究对塔什库尔干10批矮膜苞芹的药材性状、显微特征进行描述，增加检查项试验和薄层鉴别项，建立反相高效液相色谱（RP-HPLC）测定木犀草素含量方法，以期为矮膜苞芹药材质量控制提供依据。

1  仪器与试药

LC-20A高效液相色谱仪（含DAD二极管阵列检测器，日本岛津公司），AL 104型精密电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司），TG16-W微量高速离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司），HH-S型电热恒温水浴锅（江苏省金坛市医疗仪器厂），MOOTIC BA400型生物显微镜（麦克奥迪实业集团有限公司）。

矮膜苞芹，采自新疆塔什库尔干，经新疆医科大学中医学院盛萍教授鉴定为伞形科植物矮膜苞芹Hymenoleana nana Rupr.的干燥全草，10批药材（S1～S10）采集日期依次为2015-09-22、2016-07-30、2017-03-25、2017-06-22、2017-11-10、2018-03-12、2018-04-05、2018-05-12、2018-08-09、2018-08-24。木犀草素對照品（上海融禾医药科技发展有限公司，批号130610，纯度≥98%）、甲醇、磷酸为色谱纯，羧甲基纤维素钠、硅胶G254、三氯化铝等均为分析纯，水为纯净水。

2  方法与结果

2.1  药材性状

多年生草本植物，干燥全草长5～30 cm，主根较明显，粗壮，质坚硬，不易折断，圆柱形，直径0.3～1 cm，表面附有鳞片，棕褐色或灰棕色，底部有细横皱纹，基部有褐色或灰褐色残存的叶鞘。茎弯曲不分枝，圆柱形，长0.8～10 cm，直径0.1～0.5 cm，有条棱，带紫红色，质脆，中空，易折断。叶片轮廓卵状长椭圆形，黄绿色至红棕色，皱缩卷曲，质脆易脱落。顶生复伞形花序腋生，直径3～5 cm。花果期8个月，果圆形或椭圆形，有明显隆起的纵棱，果梗长0.2～0.8 cm。气微香，味微苦。见图1。

2.2  显微鉴别

药材粉末为灰棕色或灰绿色。导管多为螺纹导管，少见网纹导管和孔纹导管，直径5～17.5 μm。淀粉粒单粒或复粒，直径2～3 μm。木栓细胞较常见，多散在。草酸钙方晶或簇晶存在薄壁细胞中。偶见气孔，非腺毛单细胞长2～12.5 μm，腺毛长23～30 μm。花粉粒淡黄色，圆球形。见图2。

2.3  薄层色谱鉴别

分别精密称取10批矮膜苞芹药材粉末（过60目筛）1.0 g，置于25 mL锥形瓶中，加入甲醇10 mL，称定质量，于70 ℃加热回流1 h，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，趁热过滤，即为供试品溶液;另取2.5 mg木犀草素，加甲醇定容至10 mL，即得对照品溶液。按照2015年版《中华人民共和国药典》（四部）通则0502薄层色谱法试验，精密吸取3 μL对照品溶液和5 μL供试品溶液，分别点于105 ℃活化后的同一以0.5% 羧甲基纤维素钠为黏合剂硅胶G254薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-甲酸（18∶2∶1）为展开剂，预饱和20 min，展开后取出，晾干，喷以5%三氯化铝乙醇溶液，于105 ℃加热5 min，置紫外灯下365 nm处检视。结果供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，均出现清晰的黄色荧光斑点。

2.4  检查项

按照2015年版《中华人民共和国药典》（四部）通则0832水分测定第四法（甲苯法）进行水分测定，结果10批药材样品中水分为6.81%～7.30%，平均值为6.81%。初步拟定矮膜苞芹药材水分不得过8%。

按照2015年版《中华人民共和国药典》（四部）通则2201浸出物测定法，水不溶性浸出物采用热浸法测定，醇不溶性浸出物以70%乙醇为溶剂测定。结果10批药材中水溶性浸出物为24.10%～30.05%，平均值为28.04%;醇溶性浸出物为12.30%～17.46%，平均值为15.40%。初步拟定矮膜苞芹药材水溶性浸出物不得少于24%，醇溶性浸出物不得少于13%。

参照2015年版《中华人民共和国药典》（四部）通则2302灰分测定法进行灰分测定。结果10批药材样品总灰分为11.99%～14.47%，平均值为13.01%;酸不溶性灰分为2.93%～3.70%，平均值为3.27%。初步拟定矮膜苞芹药材总灰分不得过15%，酸不溶性灰分不得过4%。

参照2015年版《中华人民共和国药典》（四部）通则2204挥发油测定法进行挥发油测定，结果10批药材样品挥发油为1.5%～2.09%，平均值为1.80%。初步拟定矮膜苞芹药材挥发油不得少于1.5%。

10批矮膜苞芹水分、灰分、浸出物、挥发油测定结果见表1。

2.5  木犀草素含量测定

2.5.1  色谱条件

色谱柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流动相：甲醇-0.2%磷酸水溶液（75∶25）;检测波长：350 nm;流速：0.6 mL/min;柱温：30 ℃;进样量：20 μL。

2.5.2  对照品溶液制备

精密称取木犀草素对照品适量，加甲醇溶液制成浓度为13.32 μg/mL的对照品溶液。

2.5.3  供试品溶液制备

精密称取矮膜苞芹粉末1.0 g，加入20 mL甲醇，称定质量，于70 ℃加热回流2 h，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

2.5.4  系统适用性试验

取上述对照品溶液、供试品溶液适量，按“2.5.1”项下色谱条件进样测定，色谱图见图3。结果样品中木犀草素与其他组分能够基线分离，分离度>2，理论塔板数>3000。

2.5.5  线性关系考察

精密量取“2.5.2”项下对照品溶液，用甲醇分别配制成浓度为0.33、0.66、2.21、4.41、5.73、8.20 μg/mL的系列浓度，按“2.5.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以对照品进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程Y=12 056X-71 489（r=0.999 9）。结果表明，木犀草素在6.6～164 μg范围内线性关系良好。

2.5.6  精密度试验

取对照品溶液（5.73 μg/mL）适量，按“2.5.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果木犀草素峰面积RSD=0.25%，表明仪器精密度良好。

2.5.7  稳定性试验

取“2.5.3”项下供试品溶液适量，分别于室温放置0、1、2、4、6、8、12、24 h，按“2.5.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果木犀草素含量RSD=0.19 %，表明供试品溶液在室温放置24 h内基本稳定。

2.5.8  重复性试验

取同一批矮膜苞芹药材粉末6份，按“2.5.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.5.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算含量。结果木犀草素的含量RSD=1.95%，表明方法重复性良好。

2.5.9  加样回收率试验

取木犀草素含量为1.52 mg/g的矮膜苞芹药材样品9份，每份约0.5 g，置锥形瓶中，分别加入高、中、低浓度的对照品溶液，按“2.5.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.5.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率。结果平均加样回收率为99.10%，RSD=1.81%，表明回收率良好，准确度高，见表2。

2.5.10  样品含量测定

取10批药材样品粉末，按“2.5.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.5.1”项下色谱条件进样测定，平行测定3次，记录峰面积并计算木犀草素含量。结果10批矮膜苞芹中木犀草素含量分别为1.51、1.50、1.52、0.34、1.18、1.55、0.76、0.78、1.87、1.58 mg/g，表明木犀草素含量差异较大。考虑药材采收时间不同、生长年限不同，参考10批药材木犀草素含量测定结果，暂拟定矮膜苞芹药材中木犀草素的含量不少于0.3 mg/g。

3  讨论

本研究参考棱子芹属植物鉴别方法对矮膜苞芹进行鉴别。性状鉴别项下，基部残存的叶鞘、顶生复伞形花序腋生，以及果圆形或椭圆形，有明显隆起的纵棱，可作为鉴别依据。显微鉴别项下，螺纹导管及草酸钙方晶多而明显，可作为鉴别依据。

在薄层定性研究中，曾以聚酰胺薄膜和薄层板在多个展开剂下展开进行对比，发现在薄层色谱中展开得到的木犀草素斑点清晰、单一，且无拖尾。以环己烷-乙酸乙酯-甲酸（8∶5∶0.5）、三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（4∶3∶2）、甲苯-乙酸乙酯-甲醇（5∶2∶2）及三氯甲烷-甲醇-甲酸（18∶2∶1）为展开剂，最后选择三氯甲烷-甲醇-甲酸（18∶2∶1）为展开剂，所得薄层斑点清晰，Rf值介于0.2～0.5，且无拖尾现象。

参考已报道的木犀草素含量测定方法[5-8]，本试验考察了甲醇-0.2%磷酸水溶液（75∶25）、乙腈-0.4%磷酸（24∶76）和甲醇-0.2%乙酸水溶液梯度洗脱3种流动相，检测波长分别为254 nm和350 nm，流速分别为0.6、0.8、1.0 mL/min，经多次筛选，优化矮膜苞芹中木犀草素含量测定的色谱条件为：流动相为甲醇-0.2%磷酸（75∶25），流速0.6 mL/min，检测波长350 nm，出峰时间快，峰形对称，分离度>2。本方法简便，稳定性、重复性好，为塔什库尔干矮膜苞芹质量标准建立提供了一定的依据。本研究不同批次药材中检测出的木犀草素含量差异较大，可能与采收时间、采收方式、贮存时间等有关。

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（收稿日期：2018-01-10）

（修回日期：2018-01-31;编辑：陈静）