白及多糖对胃溃疡模型大鼠血清IL-2R、IL-4及胃组织Caspase-8水平的影响

巩子汉 虎峻瑞 段永强 成映霞 王强 付晓艳 杨晓轶 马骏 白敏

摘要：目的  觀察白及多糖对胃溃疡模型大鼠血清白细胞介素（IL）-2R、IL-4含量及胃组织Caspase-8表达的影响，探讨其治疗胃溃疡的作用机制。方法  60只Wistar大鼠随机分为空白组和造模组，造模大鼠采用乙酸直接烧灼法制作胃溃疡模型，将成模大鼠按随机数字表法分为模型组、阳性对照组和白及多糖高、中、低剂量组，每组10只。空白组和模型组大鼠给予10 mL/（kg·d）蒸馏水灌胃，白及多糖高、中、低剂量组大鼠分别给予白及多糖0.5、0.25、0.125 g/（kg·d）药液灌胃，阳性对照组大鼠给予雷尼替丁0.3 g/（kg·d）药液灌胃，连续15 d。ELISA检测大鼠血清IL-2R、IL-4含量，实时荧光定量PCR检测大鼠胃组织IL-2R、IL-4及Caspase-8基因表达，Western blot检测Caspase-8蛋白表达。结果  与空白组比较，胃溃疡大鼠一般生存状况较差，IL-2R含量及基因表达明显升高、IL-4含量及基因表达明显降低（P<0.05，P<0.01），胃组织Caspase-8基因和蛋白表达显著升高（P<0.05）;与模型组比较，白及多糖高、中、低剂量组大鼠IL-2R含量及基因表达均降低、IL-4含量及基因表达均升高，Caspase-8基因和蛋白表达均降低，白及多糖高剂量组差异有统计学意义（P<0.05）。结论  白及多糖通过下调模型大鼠血清IL-2R、上调IL-4含量及下调胃组织Caspase-8表达保护胃黏膜，达到治疗胃溃疡的作用。

关键词：白及多糖;胃溃疡;Caspase-8;白细胞介素-2受体;白细胞介素-4;大鼠

中图分类号：R285.5    文献标识码：A    文章编号：1005-5304（2019）10-0035-05

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.10.009      开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Abstract： Objective To observe the effects of Bletilla baicalensis polysaccharides on serum IL-2R， IL-4 level and Caspase-8 expression in model rats with gastric ulcer. Methods Totally sixty Wistar rats were randomly divided into blank group and modeling group. The gastric ulcer model was reproduced by acetic acid direct cauterization. The model rats were divided into model group， positive control group and Bletilla baicalensis polysaccharide high-， medium-， and low-dosage groups according to random number table method， with 10 rats in each group. Rats in blank group and model group were given 10 mL/（kg·d） distilled water for gavage; rats in Bletilla baicalensis polysaccharide high-， medium-， and low-dosage groups were given 0.5， 0.25， 0.125 g/kg Bletilla baicalensis polysaccharide for gavage; rats in positive control group were given 0.3 g /（kg·d） ranitidine for gavage. All groups received medicine for successive 15 d. After 15 days of treatment， serum IL-2R and IL-4 levels were detected by ELISA， and real-time fluorescence quantitative PCR was used to detect the gene expressions of IL-2R， IL-4 and Caspase-8 in stomach tissues. The protein expression of Caspase-8 was detected by Western blot. Results Compared with the blank group， gastric ulcer rats had worse general survival， higher IL-2R content and gene expression level， lower IL-4 content and gene expression level （P<0.05， P<0.01）， and higher levels of Caspase-8 gene and protein expression in stomach tissue （P<0.05）. Compared with the model group， the levels of IL-2R and gene expression in Bletilla baicalensis polysaccharide high-， medium-， and low-dosage groups decreased; the levels of IL-4 and gene expression increased; the levels of Caspase-8 gene and protein expression decreased， with statistical significance in Bletilla baicalensis polysaccharide high-dosage group （P<0.05）. Conclusion Bletilla baicalensis polysaccharide can protect gastric mucosa to treat gastric ulcer by down-regulating serum IL-2R， up-regulating IL-4 content and down-regulating Caspase-8 expression in model rats.

Keywords： Bletilla baicalensis polysaccharide; gastric ulcer; Caspase-8; IL-2R; IL-4; rats

胃溃疡作为一种常见、多发的消化性溃疡疾病，临床迁延难愈、易反复发作。研究表明，物理刺激及化学反应等引起的胃黏膜发生氧化应激损伤、促炎因子的大量释放，均是胃溃疡发病的主要因素[1-3]。白及味苦性微寒，有止血消肿、生肌敛疮功效，常与黄连、贝母、轻粉等配伍治疗疮痈已溃、久不收口者。白及主要化学成分为白及多糖已得到广泛认可[4]，其可促进大鼠胃溃疡创面的愈合，其机制可能与白及多糖提高创面羟脯氨酸成分，促进创面组织中纤维细胞、血管内皮细胞增生，提高创伤巨噬细胞数量有关[5]。本实验通过研究白及多糖对大鼠一般生存状况及其血清白细胞介素（IL）-2R、IL-4含量，以及胃组织Caspase-8基因和蛋白表达的影响，探讨白及多糖治疗胃溃疡的作用机制。

1  材料与方法

1.1  动物

SPF级健康Wistar大鼠60只，雌雄各半，2月龄，体质量（180±10）g，甘肃中医药大学医学实验中心，动物许可证号SCXK（甘）2015-0002。饲养于甘肃中医药大学SPF级实验室，温度22～25 ℃，相对湿度45%～55%，自由摄食饮水。

1.2  药物

白及多糖，纯度99%，西安泽郎生物科技有限公司，批号XAZL171026-1;盐酸雷尼替丁片，湖南汉森制藥股份有限公司，批号1808202。

1.3  试剂

冰乙酸，天津市富宇精细化工有限公司，批号20170327;乙醇，天津市富宇精细化工有限公司，批号20180222;IL-2R、IL-4酶联免疫试剂盒，上海将来实业股份有限公司，批号201901;Trizol，Ambion公司，批号152104;反转录试剂盒，TaKaRa公司，批号AI40704A;RT-qPCR试剂盒，TaKaRa公司，批号AI61180A;GAPDH抗体，ImmunoWay公司，批号B1501;Caspase-8 Anti-body，GeneTex公司，批号40044;辣根酶标记山羊抗兔IgG，北京中杉金桥生物科技有限公司，批号112971;Nuclease-Free Water，Promega公司，批号0000277459;30%制胶液，北京索莱宝科技有限公司，批号20180927;PMSF，北京索莱宝科技有限公司，批号20171113;PageRuler Prestained Protein Ladder，赛默飞世尔科技（中国）有限公司，批号00442922;Albumin Bovine V，北京索莱宝科技有限公司，批号829Q052;SDS，北京索莱宝科技有限公司，批号1029H033;Glycine，北京索莱宝科技有限公司，批号903L062;Tris，北京索莱宝科技有限公司，批号929Y071;Tris 6.8，北京索莱宝科技有限公司，批号20180322;Tris 8.8，北京索莱宝科技有限公司，批号20180928。

1.4  仪器

CT14RD型高速低温离心机，上海天美生化仪器设备工程公司;HH-4数显恒温水浴箱，江苏金坛友联仪器研究所;Benchmark Plus酶联免疫检测仪、BIOMATE 3S核酸蛋白测定仪、S1000TM反逆转录仪、Chemi DOC XRS+凝胶成像分析系统、CFX96TM Optics Module PCR仪，美国BIO-RAD公司;SCIENTZ-48型高通量组织研磨器，宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.5  造模

参照文献[6]方法：大鼠术前禁食不禁水24 h，10%水合氯醛溶液（20 mg/kg）腹腔注射麻醉，常规固定，备毛，消毒，自剑突下沿腹中线切开腹壁约2 cm打开腹腔，自肝脏后找出胃，暴露胃前壁窦体部，将自制直径5 mm、长40 mm圆柱状装置置于胃前壁胃窦部浆膜层处，吸取20 μL冰乙酸注入圆柱状装置，直接烧灼60 s，再用生理盐水清洗创口，操作完毕后覆盖网膜，间断缝合腹膜、腹壁各层组织、皮肤。

1.6  分组及给药

将60只Wistar大鼠适应性饲养3 d，按随机数字表法分为空白组、模型组、阳性对照组和白及多糖高、中、低剂量组，每组10只。除空白组大鼠正常饲养不予造模外，其余大鼠造模后第2日开始给药。阳性对照组给予盐酸雷尼替丁（300 mg/kg）药液灌胃，白及多糖高、中、低剂量组分别给予白及多糖（0.5、0.25、0.125 g/kg）药液灌胃[7-9]，空白组和模型组给予等量蒸馏水灌胃。给药体积2 mL，每日1次，连续15 d。

1.7  标本采集及处理

大鼠于末次灌胃给药后禁食不禁水24 h，10%水合氯醛溶液（20 mg/kg）腹腔注射麻醉，股动脉采血，4 ℃、3500 r/min离心10 min制备血清，置于-80 ℃冰箱保存，严格按照ELISA试剂盒说明书检测血清IL-2R、IL-4含量。称取胃组织，冻存于-80 ℃冰箱以备实时荧光定量PCR及Western blot检测。

1.8  ELISA检测大鼠血清白细胞介素-2受体、白细胞介素-4含量

按照试剂盒说明书检测大鼠血清IL-2R、IL-4含量。将试剂盒和待测血清平衡至室温，稀释准备对照品和洗涤液，按要求加样、温育、洗涤、温育、洗涤、显色、终止。酶标仪测定450 nm波长处各孔吸光度，并绘制标准曲线，计算样品浓度。

1.9  实时荧光定量PCR检测胃组织白细胞介素-2受体、白细胞介素-4及Caspase-8基因表达

采用Trizol法提取总RNA，测定其OD260/OD280均在1.8～2.0之间，反转录为cDNA，PCR扩增IL-2R、IL-4、Caspase-8基因片段。实验所用引物均由宝生物工程（大连）有限公司合成。β-actin F：5'-TGACA GGATGCAGAAGGAGATTAC-3'，R：5'-GAGCCAC CAATCCACACAGA-3'，产物长度102 bp;IL-4 F：5'-TGCACCGAGATGTTTGTACCAGA-3'，R：5'-TTG CGAAGCACCCTGGAAG-3'，产物长度92 bp;IL-2R F：5'-TACAAGAACGGCACCATCCTA-3'，R：5'-TTTCT CGATTTGTCATGGGAC-3'，产物长度94 bp。以β-actin作为内参基因，反应体系及参数依据GoTaq 3-Step RT-qPCR试剂盒说明书设置，相同模板相同基因设3复孔、6次平行实验，得各扩增反应的Ct值。采用样点拟合法分析结果得到目的基因和β-actin的Ct值，以β-actin为内参，用比较Ct值法计算相对表达量。ΔΔCt=（测试组目的基因Ct值-测试组内参基因Ct值）÷（空白组目的基因Ct值-空白组内参基因Ct值），相对表达量为2-ΔΔCt。

1.10  Western blot检测胃组织Caspase-8蛋白表达

提取胃组织蛋白，BCA试剂盒进行蛋白定量，SDS-PAGE电泳，转膜，封闭。GAPDH Antibody溶液配制（1∶1000）：GAPDH Anti-body 10 μL，封闭液10 mL;Caspase-8 Antibody配制（1∶2000）：JNK Antibody 5 μL，封闭液10 mL。37 ℃摇床4 h，1×TBST洗涤3次×10 min，加入HRP标记羊抗兔二抗。二抗溶液配制：辣根酶标记山羊抗兔（1∶5000）山羊抗兔二抗2 μL，牛奶封闭液10 mL。室温孵育1 h，1×TBST洗涤3次×10 min，采用化学发光底物进行化学发光，显影后用Bio-RAD Quantity One图像分析软件进行扫描分析。

1.11  统计学方法

采用SPSS22.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，组间均数差异比较用方差分析，方差齐用LSD法比较，方差不齐用Tamhanes'T2法比较。P<0.05表示差异有统计学意义。

2  结果

2.1  一般状况

空白组大鼠始终表现为反应灵敏，皮毛浓密光泽，活动及摄食量正常，体质量正常增长。胃溃疡大鼠第2日开始表现为眯眼、倦卧嗜睡、被毛稀疏失泽、摄食量减少、反应迟钝、每日摄食量和体质量增加减缓等。各给药组大鼠在治療第7日开始被毛稀疏失泽、反应迟钝、少食怠动、消瘦倦卧、逐渐减轻，第15日各给药组大鼠上述表现明显改善，趋于正常，尤以白及多糖高剂量组改善明显。

2.2  白及多糖对模型大鼠白细胞介素-2受体 mRNA表达和含量的影响

与空白组比较，模型组大鼠IL-2R mRNA表达和含量显著升高，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）;与模型组比较，白及多糖高剂量组和阳性对照组大鼠IL-2R mRNA表达和含量显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）。结果见表1。

2.3  白及多糖对模型大鼠白细胞介素-4 mRNA表达和含量的影响

与空白组比较，模型组大鼠IL-4 mRNA表达和含量显著降低，差异有统计学意义（P<0.01）;与模型组比较，白及多糖高剂量组和阳性对照组大鼠IL-4 mRNA表达和含量显著升高，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。结果见表2。

2.4  白及多糖对模型大鼠胃组织Caspase-8基因和蛋白表达的影响

与空白组比较，模型组大鼠胃组织Caspase-8基因和蛋白表达显著升高，差异有统计学意义（P<0.05）;与模型组比较，各给药组大鼠胃组织Caspase-8基因和蛋白表达均有下降趋势，其中阳性对照组和白及多糖高剂量组显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）。结果见表3、图1。

3  讨论

胃溃疡以周期性、节律性的上腹部疼痛为主要表现，一般认为幽门螺杆菌感染、非甾体类抗炎药的使用、缺血、应激、压力、酒精摄入、吸烟和营养不足等因素均可诱发[10-11]。《神农本草经》载：“白及味苦，主痈肿，败疽，胃中邪气，恶疮不收。”现代研究表明，白及具有止血消肿、生肌敛疮之功，对消化性溃疡疗效显著[12-13]。研究表明，白及多糖有降低应激大鼠胃黏膜损伤的作用[14-15]。

胃溃疡的发生与机体组织内炎症因子分泌水平紊乱密切相关，活化的CD4+T细胞、CD8+T细胞可产生IL-2，IL-2可促进活化B细胞增殖，其靶细胞包括T细胞、NK细胞、B细胞等[16-17]，这些细胞表面均可表达IL-2R[18]，而可溶性IL-2R是一种免疫抑制因子，在炎症反应中具有重要作用[19]。IL-4主要来源于活化的T细胞，具有抑制炎症与免疫抑制的功能，在胃肠黏膜微环境稳定中发挥重要作用[20]。研究表明，Caspase家族在细胞凋亡中发挥着重要的作用，具有Caspase级联反应，可促进细胞凋亡，尤其是Caspase-8与凋亡的关系最为密切，在细胞凋亡中起关键作用[21-22]。

本实验结果显示，白及多糖可下调模型大鼠胃组织Caspase-8基因及蛋白表达，进而调节大鼠血清IL-2R、IL-4含量，改善胃黏膜组织微环境免疫功能，降低模型大鼠血清IL-2R含量，升高模型大鼠血清IL-4含量，通过调节Caspase-8、IL-2R及IL-4等细胞因子分泌之间的平衡态，提高胃组织急慢性炎症的防御功能，调节机体的免疫机能，改善胃溃疡大鼠的一般生存状态，促进受损结肠组织黏膜修复。与模型组比较，白及多糖高剂量组大鼠一般生存状况显著改善，血清IL-2R含量和基因表达显著降低，IL-4含量和基因表达水平显著升高，胃组织Caspase-8基因和蛋白表达显著降低，提示高剂量白及多糖可显著下调Caspase-8基因和蛋白的表达，维持IL-2R和IL-4等细胞因子间的平衡，减轻由此产生的炎性级联放大反应，提高胃组织对炎症因子的防御机能，促进黏膜组织细胞的修复，进而发挥保护胃黏膜作用。

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（收稿日期：2019-04-22）

（修回日期：2019-05-14;编辑：华强）