纸中1，2-苯并异噻唑基-3（2H）-酮含量萃取过程试验设计
2019-11-15张晨夕杜显生陈丹丹
张晨夕，杜显生，陈丹丹
（牡丹江恒丰纸业有限公司，黑龙江 牡丹江 157013）
异噻唑啉酮是一种高效杀菌剂，广泛应用于造纸生产中抑制浆料的腐败、变质。由于很多种类的纸张对微生物污染都有限量要求，因此异噻唑啉酮的添加成为生产过程控制和保证产品微生物指标合格的一种有效途径。但是人体直接接触异噻唑啉酮有可能引起皮炎、过敏等反应，国家对其在食品容器和食品包装材料等中的添加也有限量要求[1]，因此有效利用异噻唑啉酮的同时保证它的使用安全性，是特殊用途纸张企业必须要考虑的问题。
对有限量要求的有效成分进行检测，需要基于实验室现有检测能力和水平进行试验设计。随着统计技术的发展，研究者在方法开发或试验设计过程中，从开发成本和方法准确度等方面考虑，都会以试验次数少、参数优化准为原则来寻求最优设计。但在实际操作中，因对响应变量有影响的可控因子和不可控因子较多，而且因子之间可能存在交互作用，因此试验模型的建立就需要有大量的数据和繁复的运算支撑。近些年被大家熟知并广泛应用的一些实验设计软件解决了这些问题。
本研究基于试验设计（design of experiments，DOE）及响应曲面分析（response surface method，RSM）等，可有效区分关键因子和噪声因子，并分析是否存在因子间交互作用及找出最佳因子水平[2]。
1 仪器与试剂
1.1 仪器
气相色谱-质谱联用仪（型号Clarus 680，质量范围为1.0～1 200 amu，铂金埃尔默仪器有限公司）；电子天平（型号MS204S，精度为0.1 mg，梅特勒-托利多国际贸易上海有限公司）；数控超声波发生器（型号KQ-500DE，昆山超声仪器有限公司）。
1.2 试剂
1，2-苯并异噻唑基 -3（2H）-酮（0.1 g/瓶，纯度：99.5%，德国DRehrenstorferGmbH，cas号为2634-33-5）；二氯甲烷（4 L/瓶，纯度为99.8%，上海安谱试验科技有限公司）。
2 优化试验设计
使用质量功能展开表对设计参数进行筛选，在1，2-苯并异噻唑基-3（2H）-酮萃取过程中，筛选出4个主要参数，包括萃取溶剂选择、萃取时间、萃取溶剂量和萃取功率，评价萃取效率高低的响应变量为加标回收率[3]。
2.1 萃取溶剂选择
用天平称取0.2 g空白纸样，采用定量加标的形式进行加标回收率分析。在50 mL具塞锥形瓶中添加20 mL萃取溶剂和80 μL内标溶液，置于超声发生器中，超声功率选择300 W超声20 min，取上清液进行离心，离心后上机分析。在同样条件下考查丙酮、正己烷、二氯甲烷分别作为萃取溶剂对1，2-苯并异噻唑基-3（2H）-酮检测结果的影响，不同萃取溶剂的加标回收率及均值如表1所示。
表1 不同萃取溶剂的加标回收率%
对不同萃取溶剂的加标回收率绘制单值-移动极差控制图，如图1～3所示。对各组数据的残差进行分析（图4），保证方法建立的模型的误差是独立的，即残差是随机的、有代表性的、等分散的。各组数应符合正态分布（图5），方差相等（图6），方可进行单因子方差分析来判断不同萃取溶剂的加标回收率是否存在差异。
图1 丙酮溶剂的加标回收率单值移动极差控制图
图2 二氯甲烷溶剂的加标回收率单值移动极差控制图
可以看到，各组数据的稳定性较好，并无超出上、下控制线（±3σ）的情况，说明数据均来自稳定受控的过程。如图5所示，3种萃取溶剂的样本量N均为10，使用Anderson-darling（AD）来检验数据拟合程度，数值均较小，拟合较好。正态检验的P值均大于0.05，各组数据均为正态，且残差随机、正态（图4）。对各组数组进行等方差检验，方差相等的概率P值＞0.05，方差相等（图 6）。
图3 正己烷溶剂的加标回收率单值移动极差控制图
图4 不同溶剂加标回收率残差图
图5 不同溶剂的加标回收率概率图
对使用不同溶剂的加标回收率进行假设检验，以验证各组数据的均值是否存在显著性差异。我们设定原假设为各溶剂间的加标回收率无显著性差异，备择假设为3种溶剂中至少有1种加标回收率与其他2种存在显著性差异。单因子方差分析结果见表2。
图6 不同溶剂加标回收率等方差检验
表2 加标回收率的单因子方差分析表
如表2所示，方法建立的数学模型的决定系数R-SQ为86.31%，即总波动中由因子引起的波动占86.31%，模型较好。不同萃取溶剂的数据组间方差与同一溶剂数据的组内方差比为F，F=85.10，组间方差较大，不同溶剂的加标回收率差异较大。在95%置信水平下，原假设成立的概率接近或为零（p值为0.000＜0.05），因此我们推翻原假设，接受备择假设，3种溶剂中至少有1种加标回收率与其他2种存在显著性差异。
单因子方差分析验证3种溶剂的加标回收率存在显著性差异，计算每种溶剂的加标回收率平均值和标准差，如表3所示。选择加标回收率高、标准差相对较小的二氯甲烷作为萃取溶剂。
2.2 萃取过程DOE摸索试验设计
表3 加标回收率的均值和标准差分析
将萃取时间、萃取功率和萃取溶剂量进行2k+4全因子试验，试验共进行12次，可安排3个参数在低、高2个水平上的所有组合，参数及参数水平如表4所示。
因试验均在相同条件下进行，所以并未进行区组化处理。随机化处理试验顺序，试验顺序见表5中“实际试验顺序”列，“中心点”列中“是”代表此次试验为中心点试验，将测得的加标回收率试验结果填至最后一列。
表4 萃取过程参数及参数水平设置
对表5试验结果进行分析，试验结果的残差符合正态性及随机性要求（图7），除考虑各参数对加标回收率的影响之外，还应考虑参数之间交互作用的影响，交互作用包括二阶交互作用和三阶交互作用。交互作用及分析结果如表6所示。
表5 全因子试验表
表6中，“效应”代表各参数取不同水平的均值之差，数值越大对加标回收率的影响越显著。“T”值为进行T检验时，不同水平各“项”的均值与总体均值之差与平均值标准差之比，衡量各“项”影响的大小。在95%置信水平下，“P”值大于等于0.05代表参数对加标回收率的影响不显著，若小于0.05，则对加标回收率有显著影响。因此，萃取溶剂量，萃取时间和萃取溶剂量的交互作用，萃取时间、萃取功率和萃取溶剂量的三阶交互作用影响都不显著，可以将这几项进行简化。
图7 加标回收率残差图
表6 摸索试验因子分析表
表7为摸索试验方差分析表。
从表7的方差分析可看到，3参数的交互作用P＞0.05，对加标回收率的影响不显著。另外从表6的“中心点”项和表7的“弯曲”项的“P”值来看，我们建立的试验模型是非线性的，存在弯曲。后续在精简后，我们将用非线性的模型对试验进行拟合。
2.3 精简后的萃取过程DOE试验设计
对影响不显著项进行逐项删除（非同时删除，需看删除后的模型是否变差），不再单独研究它们对加标回收率的影响，而是将它们列入残差里进行分析。精简后，萃取时间、萃取功率以及它们的二阶交互作用都是显著的，“中心点”项或“弯曲”项也是显著的，说明模型非线性。
2.4 响应曲面设计摸索试验
因在上述分析过程中发现拟合的模型是非线性的，所以使用响应曲面进行进一步的分析来获得因子的最佳水平。试验设计及结果见表10。
对响应曲面设计结果进行分析，结果如表11所示。
表7 摸索试验方差分析表
表8 精简后试验因子分析表
表9 精简后试验方差分析表
表10 响应曲面试验表
从表11的P值可看出，萃取溶剂量、萃取溶剂量的二次项、萃取时间和萃取功率的交互作用、萃取时间和萃取溶剂量的交互作用、萃取溶剂量和萃取功率的交互作用都是不显著的。
表11 响应曲面设计因子分析表
表12为响应曲面设计摸索试验方差分析表。
由表12可看到，模型的线性、平方和失拟都是显著的，模型存在失拟现象，需要进行优化，参数间交互作用不显著。
表12 响应曲面设计摸索试验方差分析表
2.5 响应曲面设计精简试验
表13为响应曲面设计因子分析。对不显著项逐项进行精简，精简后的数据方差分析结果如表14所示。所有项都是显著的，模型的失拟项不再显著，说明精简后模型可用。
表13 响应曲面设计因子分析表
表14 精简后响应曲面设计方差分析表
对数据绘制曲面图和等值线图，见图8和图9。
由图8和图9可看到模型为曲面模型，且在萃取时间为24～48 min、萃取功率为110～450 W时，加标回收率可达到90%以上。
图8 响应曲面设计曲面图
图9 响应曲面设计等值线图
用响应优化器对参数取值进行优化，在萃取时间取40 min，萃取功率取250 W时，加标回收率为100.272 1，符合合意性为0.972 79，此时为拟合得到的参数的最优水平，萃取溶剂量因影响不显著，可取有利于试验进行的20 mL。
2.6 验证试验
按照萃取时间40 min、萃取功率250 W和萃取溶剂量为20 mL的参数水平，使用不含BIT的空白纸张以定量加标的形式进行验证，结果见表15。
由表15可见，低、中、高含量的加标回收率分别为92.9%、95.4%、90.8%。
3 结论
图10 响应优化器
表15 方法验证数据表
在对纸中BIT组分含量进行测试的过程中，萃取过程的试验优化可以分成几个步骤：对萃取溶剂选择这个参数，可直接固定其他参数水平，然后进行单因子方差分析，选择加标回收率的均值最大、标准差最小的二氯甲烷进行萃取；其余的参数进行全因子试验设计，在摸索试验后精简对加标回收率影响不显著的参数及参数间的交互作用，因拟合的模型为非线性模型，使用响应曲面设计及响应优化器选择参数的最佳水平，分别为萃取时间40 min，萃取功率250 W，因萃取溶剂量影响不显著，可在10～30 mL根据经验取方便实际操作的值，本试验为更好地浸入试样，萃取溶剂量取20 mL。按上述参数水平进行验证试验，低、中、高含量试样的加标回收率均大于90%。
