醋酸菌的分离及初步鉴定
2019-11-15张甜马建玲刘艳全丁真真龚国利
张甜，马建玲，刘艳全，丁真真，龚国利
(1.喀什大学 生命与地理科学学院，新疆 喀什 844000；2.陕西科技大学 食品与生物工程学院，西安 710021)
我国是食醋生产和消费的大国，醋是我国传统发酵酿制的调味品之一，早在西周时期人们就用醋来调味，北魏时期的《齐民要术》中收集了22种制醋方法。食醋具有许多的保健功能和医疗功效，如对糖尿病、高血压、软化血管等具有很好的疗效[1]。清代王世雄在《随息居饮食谱》中将食醋的保健功能概括为：开胃、暖骨、强筋、消食、排出空气、醒神、解鱼、蟹鳞、介诸毒[2]。
食醋在现代居民的生活中已经不仅仅作为日常的酸味调味品，它也可作为饮料和保健品，受到人们的关注与喜爱。它是以谷物、蔬菜、果品为原料，在多种有益菌种的参与下，经历淀粉糖化、乙醇发酵及乙酸发酵这3个阶段发酵而成[3]。在乙酸发酵阶段，醋酸菌是主要的微生物，因此醋酸菌在食醋的生产中起到至关重要的作用。为了提高食醋生产的质量和产量，产酸量和酒精转化率是必不可少的考虑因素，因此，分离出潜在的醋酸菌优势菌种在食醋的生产中是十分必要的[4,5]。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 醋酸菌分离样品
醋醅(玛纳斯县国盛酱醋食品厂)；自然发酵的桃醋；腐烂的苹果。
1.1.2 试剂与实验仪器
1.1.2.1 试剂
酵母浸粉；葡萄糖；CaCO3；无水乙醇；KH2PO4；琼脂；溴甲酚紫；蛋白胨；NaOH；酚酞；冰乙酸。
1.1.2.2 实验仪器
双人单面净化工作台、生物显微镜、电子天平、全温振荡器、立式压力蒸汽灭菌锅、恒温培养箱、紫外分光光度计。
1.1.3 培养基
1.1.3.1 分离培养基(溴甲酚紫显色平板)[6]
葡萄糖1 g，酵母浸粉1 g，无水乙醇3 mL，0.4%溴甲酚紫5 mL，琼脂1.8 g，蒸馏水100 mL，121 ℃蒸汽灭菌20 min，冷却到55 ℃后加入乙醇[7]。
1.1.3.2 发酵液体培养基[8]
葡萄糖1 g，蛋白胨0.3 g，酵母浸粉1 g，调节pH至6.8，121 ℃蒸汽灭菌20 min，温度降至55 ℃时，加入无水乙醇3%。
1.1.3.3 富集培养基[9](腐烂水果)
葡萄糖1 g，酵母粉1 g，KH2PO40.5 g，调节pH至5.5，121 ℃蒸汽灭菌30 min，培养基冷却至55 ℃时，加入无水乙醇3%。
以上pH调节均使用冰乙酸。
1.1.3.4 斜面保藏培养基
葡萄糖1 g，酵母浸粉1 g，CaCO32 g，琼脂2 g，无菌水100 mL，在0.1 MPa，121 ℃灭菌20 min，温度降至55 ℃时加入4 mL无水乙醇，制备成斜面。
1.2 方法
1.2.1 菌种分离方法
样品→梯度稀释→分离→纯化→革兰氏染色→斜面保藏→产酸量测定→酒精转化率。
1.2.2 样品分离培养
1.2.2.1 醋醅样品
称取10 g搅拌均匀的醋醅样品，置于含有90 mL无菌水的250 mL三角瓶中，晃动5 min，获得的即为醋醅10-1稀释液，10倍梯度稀释后，得到10-2～10-8稀释液样品，将稀释的溶液各取0.2 mL涂布于分离培养基上，30 ℃倒置培养48 h[10]。
1.2.2.2 发酵桃醋样品
量取1 mL的桃醋样品，加入到含有9 mL无菌水的试管中，稀释至10-8，将稀释液0.2 mL涂布于分离培养基上，30 ℃培养2～3 d。
1.2.2.3 腐烂苹果样品
取苹果的腐烂部分，接种于富集培养基中，置于振荡器上，30 ℃，150 r/min振荡使其生长2～3 d以获得富集的培养溶液，进行梯度稀释后，分别取0.2 mL上述富集培养液涂布于分离培养基中培养2～3 d[11]。
1.2.3 纯化与保藏
将3个样品的细菌悬浮液分别涂布于溴甲酚紫平板上，产酸细菌会释放出酸，可将平板上靛蓝的溴甲酚紫变成黄色，菌落周围的培养基呈现黄色的变色圈，从而达到分离产酸菌的目的。在培养2～3 d后从平板中挑出具有清晰变色圈的单个菌落，在分离培养基中多次纯化，30 ℃培养48 h，挑选出生长优势且特征明显的单菌落接种于斜面培养基上，4 ℃保藏[12]。
1.2.4 初步鉴定
形态观察：对纯化后获得的单菌落，观察其基本形态特征，并进行革兰氏染色。
1.2.5 菌体浓度的测定
将筛选出的单菌落接种到发酵液体培养基中，置于振荡器中，30 ℃，150 r/min振荡培养，使用紫外分光光度计，每隔12 h在OD600下测定细胞浓度。
1.2.6 产酸量的测定
在含有50 mL蒸馏水的小烧杯中加入上述振荡器中培养的发酵液2 mL，然后加入3～5滴0.5%酚酞溶液，用0.1 mol/L的氢氧化钠溶液滴定，当溶液滴至淡粉色时，以消耗氢氧化钠溶液的体积来计算产酸量[13-15]。
式中：V为发酵液样品所消耗的NaOH溶液的体积；V0为对照组(空白培养基)滴定所消耗的NaOH溶液的体积；60为醋酸的摩尔质量。
1.2.7 耐醇度的测定
取上述发酵液，将菌体浓度相同的各株醋酸菌菌液，以5%的接种量分别接种于5个乙醇浓度梯度的100 mL发酵液体培养基中，乙醇浓度分别为5%、7%、9%、11%和13%，于30 ℃，150 r/min振荡培养3 d，取2 mL发酵液，加入含有50 mL蒸馏水的小烧杯中，测定产酸量，同时，测定5株菌的乙醇转化率。
2 结果
2.1 产酸菌的筛选
根据上述产酸菌的分离方法获得产酸菌菌落。挑取长势优良、变色圈明显的单菌落进行平板划线分离，获得5株产酸菌株，分别为C1、C2、C3、A1和T1，见图1。
图1 5株菌在分离培养基上的形态
革兰氏染色结果表明，5株产酸菌株中3株为阳性，其余2株为阴性，具体表型特征见表1。
表1 产酸菌株的形态特征
2.2 菌液浓度测定结果
将产酸菌株接入液体培养基中进行发酵，每隔12 h取样，测定光密度。
图2 产酸菌株的生长曲线
由图2可知，5株产酸菌均有延滞期，A1和C2培养2 d后，C3和T1培养4 d后均进入对数期，C1菌株生长曲线变化不明显；A1和C2生长速度较快，分别在发酵3 d和4 d后进入稳定期。
2.3 菌株产酸量的测定
对5株菌分别进行产酸量的测定，结果见图3。
图3 菌株产酸量
在3%乙醇含量的基础发酵液体培养基中，菌株的产酸速度各异，C1、C2、C3的产酸速度较快，C2和C1的产酸量在培养5 d后达到最大值，分别为15.8 g/L和11.2 g/L，其余菌株的最高产酸量均低于10.0 g/L。综合图2和图3还可知，5株菌的产酸能力和生长具有一定关联，随着菌体密度不断增大，产酸量也明显上升。
2.4 菌株酒精转化率的测定
醋酸菌能够将高浓度乙醇快速地转化成醋酸，是生产高浓度醋酸的必要条件，但是高浓度的乙醇反而会抑制醋酸菌的生长，对不同乙醇浓度下醋酸菌的产酸量和乙醇转化率进行测定，结果见图4和图5。
图4 各菌株在不同乙醇浓度下的产酸量
图5 各菌株在不同乙醇浓度下的酒精转化率
由图4和图5可知，C1在5%乙醇浓度时产酸量和乙醇转化率最高，分别为12.9 g/L和19.8%；C2在7%乙醇浓度时产酸量最高，达到36.3 g/L，在5%乙醇浓度时乙醇转化率最高，为42.33%；T1在5%乙醇浓度时产酸量和乙醇转化率最高，分别为28.2 g/L和43.25%；而C3和A1在各乙醇浓度下产酸量和乙醇转化率均较小。
3 结论
本实验从醋醅、发酵桃醋和腐烂苹果中分离出5株菌株，分别为C1、C2、C3、T1和A1，均可氧化乙醇产酸，结合菌落形态特征，初步鉴定为醋酸杆菌属，其中C1、C2和T1为革兰氏阳性菌，C3和A1为革兰氏阴性菌。C1在5%乙醇浓度时产酸量和乙醇转化率最高，分别为12.9 g/L和19.8%；C2在7%乙醇浓度时产酸量最高，达到36.3 g/L，在5%、7%乙醇浓度时乙醇转化率分别为42.33%和39.77%；T1在5%乙醇浓度时产酸量和乙醇转化率最高，为28.2 g/L和43.25%；而C3和A1在各乙醇浓度下产酸量和乙醇转化率均较小。综上所述，C2为高产醋酸的菌株。
