新疆地区汉族老年人阿尔茨海默病和轻度认知功能障碍患者的外周血DNA绝对端粒长度☆

赵永杰 邹婷 段世伟 周晓辉

轻度认知功能障碍（mild cognitive impairment，MCI）的患者主要表现为记忆力减退，并存在一个或几个认知领域的功能障碍，但社会职业或日常生活未受影响，尚不足以诊断为痴呆[1]，通常被认为是从正常衰老到痴呆的过渡阶段[2]。AD及MCI的发病机制复杂，近年来越来越多的研究发现，外周血DNA的ATL可能同其发病相关[3]，且不同地区研究结果差异较大，提示其发病可能受环境及地域的影响[4-5]。新疆为多民族聚居地区，其中以维吾尔族和汉族为常住居民，其地理环境及饮食习惯与中国其他地区存在较大差异。进而导致新疆汉族人群生活习惯受其他少数民族的影响较大，致使其可能与内地汉族人群在导致AD及MCI发病的表观遗传学机制方面存在差异。本研究选取新疆地区60岁及以上的汉族老年AD和MCI患者，采用横断面的研究方法，旨在探讨新疆地区汉族老年人AD和MCI患者ATL差异，为进一步研究新疆汉族AD及MCI患者发病机制提供理论基础。

1 对象与方法

1.1 研究对象选择在2017年1月至2018年5月于新疆医科大学第一附属医院老年病科就诊的年龄≥60岁、教育程度从文盲到研究生的老年人，根据美国精神病学会精神障碍诊断和统计手册Ⅳ修订版（DSM-Ⅳ）[6]AD和MCI的诊断标准进行病例及对照的筛选。AD纳入标准：采用简易精神状态检查（mini-mental state examination，MMSE），对得分小于下限（文盲组≤17分、小学组≤20分、中学及以上组≤24分）[7]的有认知能力损害的患者，进一步做蒙特利尔认知评估量表（Montrealcognitive，Moca）、日常生活能力评定（activity of daily living，ADL）、缺血量表 （Hachinski ischemic scale，HIS）、临床痴呆评定量表（clinical dementia rat ing，CDR）、总体衰退量表（gobal deterioration scale，GDS）等。MCI纳入标椎：①MMSE评分：文盲18～21分，小学文化程度21～24分，中学文化程度25～27 分；②GDS评分为 2～3 级；③HIS≤4[8]。 排除标准：①排除患血管性痴呆、路易体痴呆、额颞叶痴呆等疾病的患者；②排除由于谵妄、重性抑郁、精神分裂症所致患者；③排除依从性不好，不签署知情同意书的老人。对照组纳入标准：选取性别、年龄与病例组相匹配、日常生活功能良好、否认神经中枢性系统疾病史及痴呆家族史的老年人。对照组排除标准：排除近3个月内有急性脑血管疾病史，排除可能导致痴呆的系统性疾病（例如甲状腺功能减退、维生素B12或叶酸缺乏、低血钙、HIV感染）的老人。共入选AD组37例（男 20例，女 17例），MCI组 63例（男 27例，女 36例），对照组126例（男51例，女 75例）。本研究获得新疆医科大学第一附属医院伦理委员会的批准，获得受试者同意并签署了知情同意书。

一般资料采集：统一收集所有研究对象的年龄、性别等一般资料以及既往病史资料（高血压、糖尿病病史、吸烟、饮酒史等）；

血样采集：采集所有受试者的晨间空腹外周静脉血5 mL，取部分外周血在新疆医科大学第一附属医院检验科进行空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）、甘油三酯（triglyceride，TG）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、高密度脂蛋白（highdensity lipoprotein，HDL）、低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）等相关生化指标的检测；其余外周血存放于-80℃冰箱中，作为全基因组 DNA的提取用。

1.2 外周血全基因组DNA的提取DNA的分离：用 E.Z.N.A.TM血液 DNA试剂盒（OmegaBio-Tek，诺克罗斯，美国）从血液中提取DNA，操作上严格按照说明书上进行。使用P2000分光光度计（Telo Fisher HealthInc.，Waltham，MA，美国）测量 DNA浓度。生物公司根据相关文献[9]设计端粒引物，并提供了实验相关试剂。

1.3 反应体系按照2×MasterMix 5.0 μL，上下游引物各 0.5 μL，Template 1.5 μL，H2O 3.0 μL 的反应体系置于96孔板 （上海晶安生物科技有限公司）上，并封膜冰箱内保存，将完全标准品作为阳性对照（Thermo Fisher Scientiific，Uppsala，Sweden），水为阴性空白对照，于罗氏480荧光定量PCR仪器（Roche，Basel，Switzerland）中按操作步骤全自动检测。

1.4 绝对端粒长度测量通过实时荧光定量聚合酶链反应法（RT-PCR）检测外周血DNA的端粒重复拷贝数（T）和内参单拷贝基因36B4基因的拷贝数（S），将倍比稀释的标准品和待测的样本进行PCR反应，并将实时荧光定量PCR中的Ct值表示为每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时的循环数，根据4个标准品的Ct值设立标准曲线，数据主要由PCR仪配套软件收集（如图1）。对不同引物分别分析，各自的标准曲线用于分析样本的这个基因的拷贝数。使用如下公式得到相应的绝对端粒长度：端粒长度=端粒拷贝数/对照拷贝数/92×6。

图1 测试样品的溶解曲线及标准曲线图

ROCHE480程序为： 总变性：95℃，10 min；循环 （45x）：95℃ 15 s，60℃ 1 min； 收集溶解曲线：95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 10 s；降温：40℃ 10 s；备注：收集荧光，持续收集荧光。

1.5 统计学方法采用SPSS 20.00进行统计分析。符合正态分布的计量资料以 表示；计数资料以M（QL，QU）表示；符合正态性和方差齐性检验的三组计量资料比较采用方差分析，计数资料比较采用χ2检验；不符合正态性和（或）方差齐性检验的三组计量资料间及组间的两两比较采用秩和检验；采用双变量相关分析方法计算ATL与各项临床指标的相关性，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 一般资料比较三组间一般资料在性别、年龄、空腹血糖、TG、TL、LDL原发性高血压、糖尿病、吸烟和饮酒状况等比较中均未发现统计学差异（P＞0.05）（见表 1）。

2.2 ATL在AD、MCI和对照组间的比较AD组ATL 为：0.0503（0.0446，0.0543），MCI组为：0.0464（0.0456，0.0476）， 对照组为：0.0479（0.0463，0.0501），三组间相比差异具有统计学意义（P＜0.05）；其中，MCI组短于 AD 组（P=0.001），且短于对照组（P=0.0006），而 AD组 ATL与对照组相比无统计学差异（P＞0.05）（见图 2A）。

2.3 分层分析后AD、MCI和对照组的ATL（见表2）

2.3.1 按性别分组后ATL在AD、MCI和对照组间的比较（图2B）男性中，ATL在AD组、MCI及对照组间相比差异具有统计学意义（P＜0.05）；其中，MCI组ATL短于AD组（P=0.012），且短于对照组（P=0.040）。女性中，ATL在 AD 组、MCI及对照组间相比差异具有统计学意义（P＜0.05）；其中，MCI组ATL短于对照组（P=0.007）。

2.3.2 按文化程度分组后ATL在AD、MCI和对照组间的比较（图2C）高中以下学历者中，ATL在AD组、MCI及对照组间相比差异具有统计学意义（P＜0.05）；其中，MCI组短于对照组（P=0.002）。 高中及以上学历者中，ATL在AD组、MCI及对照组间相比差异具有统计学意义（P＜0.05）；其中，MCI组短于AD组（P=0.015）。

表1 AD组、MCI组和对照组间一般资料比较

2.3.3 按是否患高血压分组后ATL在AD、MCI和对照组间的比较（图2D）未患高血压者中，ATL在AD组、MCI及对照组间相比差异具有统计学意义（P＜0.05）；其中，MCI组短于对照组（P=0.041）。患有高血压者中，ATL在AD组、MCI及对照组间相比差异具有统计学意义（P＜0.05）；其中，MCI组短于 AD组（P=0.001），MCI组短于对照组（P=0.009）。

图2 外周血DNA的ATL在AD、MCI和对照组间的比较 A：三组之间的比较；B：性别分层中三组之间的比较；C：文化程度分层中三组之间的比较；D：是否患高血压分层中三组之间的比较；E：在年龄分层中三组之间的比较

2.3.4 按年龄分层分组 外周血DNA的ATL在AD、MCI和对照组间的比较，（图2E）年龄在60～75岁者中，ATL在AD组、MCI及对照组间相比差异具有统计学意义（P＜0.05）；其中，MCI组短于对照组（P=0.009）。年龄在 76～90 岁者中，ATL 在 AD组、MCI及对照组间相比差异具有统计学意义（P＜0.05）；其中，MCI组短于 AD 组（P=0.008），MCI组短于对照组（P=0.018）。

表2 按性别及文化程度分组后AD、MCI及对照组的ATL

2.4 各组外周血DNA的ATL与相关临床指标的相关性从表3可见，在MCI组中，ATL与年龄呈正相关（r=0.264，P=0.037），余均未发现相关性。

表3 AD组、MCI组及对照组ATL与各项临床指标的相关性

3 讨论

端粒可以保护携带遗传信息的染色体的完整性，随着年龄的增长，端粒长度逐渐缩短[10]，当端粒长度缩短到临界值时，细胞将不再分裂，从而引起机体衰老以及其他功能失调[11-12]。有研究结果显示，生活方式的不同会影响外周血DNA的 ATL，如 LIAN[4]和 RAFIEL等[5]的研究均表明，遵循健康生活方式 （包括较高的水果和蔬菜摄入量）的个体，外周血白细胞端粒长度较长。且近年来国外研究发现ATL在不同认知水平患者中的差异，2006 年 HONIG 等[13]、2011 年HOCHSTRASSER等[14]、2012年HONIG 等[15]、2019年曼玉奎等[16]的研究结果均表明，AD患者ATL较对照组明显下降；然而，MOVERARE-SKRTIC 等[17]于2011 年的研究则表明，AD患者外周血DNA的ATL与健康对照组相似，MCI患者外周血DNA的ATL较AD及对照组缩短。

本研究结果显示MCI组外周血DNA的ATL较AD组及对照组显著缩短，而AD组与对照组间ATL无差异，且在性别、文化程度、是否患高血压及年龄的分层分析中也发现了MCI组ATL显著缩短，该研究结果提示了在AD患者中可能存在某种使其端粒长度维持稳定的机制。国外已有学者对其做了相关研究[18-20]，AD患者ATL维持稳定的原因可能在于：首先，AD会导致体内某些细胞丢失，而这些细胞中包含短端粒长度的细胞数目较多，同时这些细胞内伴随有端粒的损耗以及亚端粒低甲基化的发生；其次，AD患者外周血中白细胞最长端粒数目成比例下降，中等长度端粒数目增加，最短端粒数目不变导致了AD患者中的端粒长度偏于正常，而MCI患者中不存在上述生物学过程，进而使得MCI患者中ATL较AD组及对照组中短。

然而本研究在分层分析的两两比较中未发现女性AD组与MCI组间、文化程度在高中以下AD组与MCI组间、文化程度在高中及以上MCI组与对照组间、未患高血压AD组与MCI组间、年龄在60～75岁AD组与MCI组间ATL存在差异，其原因可能在于ATL在女性中受到绝经年龄早晚的影响[21]，绝经年龄较晚的妇女ATL比绝经年龄较早的妇女要长，本研究中未能采集女性患者的绝经年龄，在绝经年龄中可能存在选择偏移导致以上结果；其次，较低的受教育程度可能会掩盖认知功能下降的诊断[22-23]，进而导致文化程度较低的患者诊断准确率下降，从而结果中出现ATL变化不明显；分层分析结果尚需扩大样本量进一步验证。

目前有研究认为，AD、MCI组端粒长度与年龄呈负相关[24]，而在本研究结果分析中，MCI组端粒长度与年龄之间呈正相关，由于本研究中样本量较少，结果尚需扩大样本量进一步验证。

综上所述，本研究发现新疆地区汉族老年AD、MCI及正常对照组中外周血DNA的ATL存在差异，为AD及MCI发病机制的研究提供理论基础。该结果与国内研究结果存在差异，而与国外SOFIA MS等的研究结果相似，其原因可能在于新疆特殊的地理环境及饮食习惯。本研究结果提示AD患者中可能存在某种其ATL维持稳定的机制，但尚需进一步研究。