疑似非洲猪瘟病料的采集、保存和送检

陈峰　党安坤　徐淑华　楚遵锋　曹振山　陆峰　蔺晓月　兰邹然

摘要：非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒感染引起的猪的急性、热性和高度接触性传染病，自2018年8月3日发现第一例非洲猪瘟疫情起截止2018年底，全国共有20多个省份发生近100起家猪及2起野猪感染非洲猪瘟疫情。全国启动了重大疫情Ⅰ级响应，防控形势险峻。这使得基层兽医工作者和防疫员等工作人员更要在病料采集和储存等工作中注重生物安全和防范意识。笔者从病料采集、样品保存和样品运输三个方面探讨了当下实际操作中应该注意的操作事项，并通过相关资料整理了规范的操作方法仅供大家参考。

关键词：非洲猪瘟;病料采集;基层兽医;防疫员

非洲猪瘟（African swine fever，ASF）是由非洲猪瘟病毒感染引起的猪的急性、热性和高度接触性传染病，临床以高热、食欲废绝、皮肤和内脏器官出血及高死亡率为特征，属于世界动物卫生组织（OIE）要求法定报告的动物疫病。中国动物病原微生物名录中，其被列为一类动物疫病。中国自2018年8月3日发生第一例非洲豬瘟疫情起，截止2018年底，中国共有20多个省份发生近100起家猪及2起野猪感染非洲猪瘟疫情。中国启动了重大疫情Ⅰ级响应，防控形势险峻。这使得基层兽医工作者和防疫员等工作人员更要在病料采集与储存等工作中注重生物安全和防范意识。笔者为此，把病料采集、保存和运输方面相关的经验资料和自身实践操作中注意事项进行了整理，希望能为广大兽医工作者提供帮助。

1临床及病理诊断

1.1临床症状

体温通常升至41℃以上，食欲废绝、怕冷;皮肤潮红充血甚至发绀，在耳、鼻、腹壁、尾、外阴和肢端等无毛或少毛部位更为明显，甚至呈淤斑、血肿和坏死斑;在病后期常伴有出血性肠炎，表现腹泻和血便等症状。

1.2病理变化

因血管内皮细胞严重受损而导致各器官组织发生严重的充血、出血、水肿、坏死和梗死等，淋巴结肿胀，边缘呈红色，以肠系膜淋巴结等出血最为严重，呈紫红色，如血瘤状。在喉头、膀胱黏膜和心肺等实质器官表面呈点状出血。实质器官中脾脏病理变化较为明显，充血肿大，多呈黑色。心包积液，胸水和腹水增多。

2样品的采集

2.1病原学检测的样品采集

2.1.1血液病猪血液的采集一般采用耳静脉或前腔静脉采血方式，先用注射器吸取枸橼酸钠或肝素抗凝剂，再采集血液5mL，颠倒混匀后，注入无菌容器，如条件允许，最好每份血液

样品采集2管，作为备份样品保存。因采血管的普及，也可用已经含有抗凝剂的真空采血器直接抽取血液。

2.1.2实质器官检测非洲猪瘟病毒，脾脏是最重要的器官，首先选择脾脏，其次是淋巴结。解剖病猪时，无论其脾脏和淋巴结有无病理变化，都应在采集样品范围之内。采取淋巴结时多同周围脂肪整个采取。其他器官可选择有病变且明显的部位，以无菌器械采取直径1cm左右的组织样品，加入到含有100μg/mL青霉素和链霉素的PBS溶液中，4℃保存运输。或保存于含50%甘油的PBS溶液中，4℃保存运输。为保持病毒的感染性，样品送达实验室后，应立即放入-80℃低温冰箱内冷冻保存。

2.1.3其他样品鼻液：可以用灭菌棉拭子擦取鼻黏膜上的分泌物，保存于无菌容器内。粪便：用清洁的玻璃棒等，挑取新鲜粪便少许，约1g左右，保存于无菌容器内;也可用棉拭子，在直肠内直接掏取。仔猪尸体和流产胎儿：应用灭菌纱布包裹后，装入能密封的塑料袋中，保持低温，一般建议-40℃以下最佳，并整体送检。

非洲猪瘟比普通猪瘟造成的猪喉及会厌部位瘀斑充血以及出血更为严重。这些部位也可以作为病料采集。另外，蜱在非州和欧洲很多国家是重要的生物虫媒，但是在中国还未见相关报道。对于蜱的采集一般使用手工方式，但比较费时费力。在非洲和欧洲一些国家采用二氧化碳诱捕法和真空抽吸法等方法用于大规模的田间蜱样品采集。

2.2血清学检测的样品采集

对于疑似非洲猪瘟的病猪进行血清学样品采集时，需要对患病猪、健康猪以及处于不同发病阶段的猪，分别无菌采集血清。采集全血3-5mL，可以室温放置12-24h，收集自然析出的血清，现如今更普遍使用离心分离血清的方法。收集的血清置于无菌器皿中，密封，标记后送检。

2.3病理组织学检测的样品采集

解剖有典型病变的部位，连同附近的健康组织一起采集。一个组织器官上如有不同病变时，应分别采集。取出的样品用清水冲洗血污后，立即放入固定液中。采集的样本应切成1-2cm左右大小。使用的固定液为10%的福尔马林，固定液的用量应为标本体积的10倍以上。

2.4采集注意事项

2.4.1样品取材合乎规范当怀疑病猪是非洲猪瘟时，应按照《非洲猪瘟防治计划规范》的详细要求，进行病料采集，同时怀疑患有其他感染疾病时，应综合分析，全方位取材。死亡动物应及时取材，夏季一般不超过4h，以防止被取材动物组织出现腐败、自溶和变性等情况影响检测结果。

2.4.2避免交叉污染，注重生物安全时刻保持避免交叉污染的头脑意识，以免因污染而影响实验数据。取材现场要注重生物安全工作，做好个人的防护工作，并采取必要的措施防止污染环境，避免人为散播疫病。更应该做好环境消毒和动物尸体的无害化处理等工作。

3样品保存的注意事项

3.1血液类样品

血清或抗凝全血送检应放置于4℃保存，冷藏送至检测实验室。到达实验室后应置于-20℃保存。如需要长时间保存应放置于-80℃超低温冰箱中。

3.2组织样品

例如脾脏和淋巴结等可在50%中性甘油溶液或含IOOμg/mL青霉素和链霉素的PBS溶液中4℃冷藏运输。到检测实验室后立即存放于-80℃超低温冰箱中。

3.3注意事项

所用到的保存液，需要充分灭活，要确保容器的密封性无误。保存时要把检品做好分类，填写相应的标签便于寻找和取用。要时刻有保持新鲜及避免污染的操作意识。

4送检运输中样品注意事项

4.1选择合适的包装

样品的包装应符合《病原微生物实验室生物安全管理条例》《高致病性动物病原微生物实验室生物安全管理审批办法》《高致病性动物病原微生物菌（毒）种或者样品运输包装规范》，并且要同时符合航空、铁路和公路等交通管理的相关规定。

使用与冷藏时间相匹配的冷藏设备，如需要冷藏时间过长，中途可更换冷却剂。根据路途长短选用相应的储存容器。更应充分考虑到运输过程中可能发生的风险，例如撞击和震动。尽量使用不易破碎的容器。

4.2做好相关的登记

在内容物和外包装上，进行编号，并详加记录，填写送检单时应一式三份或多份，并做好存档工作，运输前应事先与检验检测单位取得联系，并且以书面或者电话的方式做好疫情的说明。条件允许的情况下，尽量指派专人送检。

5总结

非洲猪瘟疫情正在中国发生。在防控的关键时期如何做好非洲猪瘟病料的采集和送检，至关重要。采集好病料并安全送检，一方面能提供有价值的样品，对非洲猪瘟的确诊提供有效的样品支持;另一方面在非洲猪瘟疫区规范的取材和运输，能减少环境污染和运输沿线的污染，切断一条重要的污染途径。在取材的地点，应提前对环境进行防护和消毒工作。避免因取材而导致的病原微生物的扩散，污染养殖场。保存运输方面，应掌握“保持新鲜，避免污染”的原则。

当然，非洲猪瘟的传播途径是复杂多样的，只有更全面的加强防控意识和防控手段，才可能更有效的对非洲猪瘟实施防控。疾病的发生都具有一定的复杂性，往往可能是多种疾病混合感染导致的，在取材过程当中应结合病症和病理变化进行取材。

目前虽然仍在研制开发疫苗，但尚未成功，且无有效的治疗方法。一旦确诊发生本病，应采取严格封锁和强制性的扑杀措施。并对疫区周围猪群进行细致的血清学检查，排除隐性感染猪的存在。