辛伐他汀对慢性心力衰竭兔心肌细胞凋亡的影响

杨秀丽，孙海燕，潘瑞阳，赵奕霖，杨 萌，黄宏伟，王显良，赵国安

(1.新乡医学院第三附属医院心血管内科，河南 新乡 453003；2.新乡医学院第一附属医院心血管内科，河南 卫辉 453100)

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)是各种心脏疾病发展到终末阶段的一组临床综合征,是心血管疾病患者的主要死亡原因，降低CHF的发病率、病死率已成为公共卫生问题。因此，研究心力衰竭发病机制、寻找新的治疗靶点具有重要意义。心肌细胞凋亡是心力衰竭的重要发病机制之一，阻止细胞凋亡可减轻心脏重构和心力衰竭程度。研究表明，心力衰竭发生时左心室功能恶化是心肌细胞反复丢失和剩余心肌细胞收缩功能逐渐退化的结果，而凋亡可能是心肌细胞不断丢失的原因之一[1]。Fas/FasL是体内直接启动细胞凋亡的信号传导系统[2]，是机体维持自身稳定的重要调控途径，该系统异常表达与多种疾病的发生、发展有关。p53基因是一种抑癌基因，野生型p53基因的主要作用是调节细胞生长及细胞凋亡，参与心血管系统细胞凋亡的发生[3]。研究表明，p53基因具有促进心肌细胞凋亡的作用，p53蛋白参与多种损伤所致的心肌细胞凋亡过程，且p53途径是细胞凋亡连锁反应中的重要核心[4]。他汀类药物除具有调节血脂作用外，还具有抗炎、抑制心肌肥厚、抗心肌纤维化等多项效应。研究显示，他汀类药物能降低心脏猝死发生率，具有抗凋亡作用[5-6]。本研究通过建立兔CHF模型，并给予辛伐他汀进行干预，旨在探讨他汀类药物对CHF兔心肌细胞凋亡、血清可溶性Fas(soluble Fas,sFas)水平、心肌p53蛋白表达的影响及其机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物健康新西兰大耳兔36只，雄性，体质量1.6～2.3 kg，由新乡医学院实验动物中心提供(批号：2016A509)。

1.2 药物、试剂与仪器注射用盐酸多柔比星购自山西普德药业有限公司(国药准字H14023143)，辛伐他汀购自山东方明药业股份有限公司(国药准字H20063146)，sFas检测试剂盒购自美国R&D公司；p53抗体、SP免疫组织化学试剂盒购自北京中杉生物技术公司，MyLabFive动物彩色超声诊断仪购自意大利百胜公司。

1.3 实验方法

1.3.1 实验分组及兔CHF模型建立将36只兔随机分为正常对照组、CHF组和辛伐他汀组，每组12只。CHF组和辛伐他汀组兔经耳缘静脉注射注射用盐酸多柔比星1.5 mg·kg-1(使用前以生理盐水稀释)，每周1次，连续10周，注射完成后再观察2周；辛伐他汀组兔在首次注射多柔比星时开始给予辛伐他汀1.5 mg·kg-1，灌胃，每日1次，连续12周；正常对照组兔经耳缘静脉注射生理盐水，给药方法同CHF组。

1.3.2 心脏超声心动图检查实验12周后，3组兔经耳缘静脉注射200 g·L-1乌拉坦(5 mg·kg-1)麻醉，行超声心动图检查，分别测量左心室收缩末期内径(left ventricular end-systolic dimension,LVESD)、左心室舒张末期内径(left ventricular end-diastolic dimension,LVEDD)、左心室短轴缩短率(left ventricular fractional shortening,LVFS)及左心室射血分数(left ventricular ejection fraction,LVEF)。

1.3.3 样本采集及处理兔心脏超声心动图检查后，颈动脉取血5 mL，4 ℃、3 000 r·min-1离心15 min，取血清，置于-70 ℃冰箱保存待测。然后，采用空气栓塞法处死兔，游离左心室心肌，放入40 g·L-1多聚甲醛溶液中固定，石蜡包埋，以备心肌细胞凋亡及p53蛋白表达检测。

1.3.4 血清sFas水平检测采用酶联免疫吸附试验检测血清sFas水平，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.3.5 心肌细胞凋亡检测采用末端脱氧核苷酰基转移酶介导性dUTP切口末端标记(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)法检测心肌细胞凋亡情况。取石蜡包埋的心肌组织连续切片，脱蜡、水化，磷酸盐缓冲液浸洗，二氨基联苯胺显色，苏木精复染，脱水、透明、封片、镜检。细胞核呈棕黄色或棕褐色者为凋亡细胞，细胞核呈紫蓝色者为非凋亡细胞。每一切片选取5个高倍视野(×200)，计算凋亡细胞数，并计算细胞凋亡指数，细胞凋亡指数=(凋亡细胞数/细胞总数)×100%。

1.3.6 免疫组织化学法检测兔心肌细胞中p53蛋白表达取石蜡包埋的心肌组织连续切片，脱蜡，高压抗原修复，滴加正常动物血清，过夜，滴加一抗4 ℃过夜，滴加生物素标记的二抗，滴加链霉抗生物素蛋白-过氧化物酶复合物，二氨基联苯胺显色，苏木精复染，脱水，透明，封片。p53蛋白阳性表达为细胞质中出现褐色颗粒。在显微镜下取5个高倍视野(×200)，计数阳性细胞数，计算每个视野阳性表达细胞所占的比例，取均值即为每张切片阳性表达细胞率。

2 结果

2.1 3组兔存活情况正常对照组和辛伐他汀组兔全部存活，CHF组兔死亡2只。

2.2 3组兔心脏超声心动图比较结果见表1。与正常对照组比较，辛伐他汀组和CHF组兔LVESD、LVEDD显著增大，LVEF、LVFS显著下降，差异均有统计学意义(P<0.05)；与CHF组比较，辛伐他汀组兔LVESD、LVEDD减小，LVEF、LVFS升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。

表1 3组兔LVESD，LVEDD，LVFS及LVEF比较

组别nLVESD/mmLVEDD/mmLVFS/%LVEF/%正常对照组128.35±0.5412.20± 0.5628.37±1.0762.00±1.13CHF组1012.21±0.54a17.51±0.57a17.62±1.29a37.37±1.44a辛伐他汀组1210.17±0.48ab13.69±0.34ab24.15±0.76ab49.18±3.14ab

注：与正常对照组相比aP<0.05；与CHF组比较bP<0.05。

2.3 3组兔血清sFas水平比较正常对照组、CHF组和辛伐他汀组兔血清sFas水平分别为(8.42±0.14)、(11.7±0.55)、(9.43±0.35)mg·L-1；CHF组和辛伐他汀组兔血清sFas水平高于正常对照组，差异有统计学意义(t=5.347、6.125，P<0.05)；辛伐他汀组兔血清sFas水平低于CHF组，差异有统计学意义(t=3.29，P<0.05)。

2.4 3组兔心肌细胞凋亡指数比较结果见图1。正常对照组偶可见凋亡细胞，CHF组兔可见大量凋亡细胞，辛伐他汀组凋亡细胞显著少于CHF组。正常对照组、CHF组和辛伐他汀组兔心肌细胞凋亡指数分别为1.08±0.12、16.13±1.17、4.86±0.11；CHF组和辛伐他汀组兔心肌细胞凋亡指数高于正常对照组，差异有统计学意义(t=3.285、4.398，P<0.05)；辛伐他汀组兔心肌细胞凋亡指数低于CHF组，差异有统计学意义(t=6.541，P<0.05)。

A：正常对照组；B：CHF组；C：辛伐他汀组。

图1 3组兔心肌细胞凋亡情况(TUNEL法，×200)

Fig.1 Cardiomyocyte apoptosis of rabbits in the three groups (TUNEL method,×200)

2.5 3组兔心肌细胞中p53蛋白阳性表达比较结果见图2。正常对照组兔心肌细胞内较少棕黄色颗粒沉积，p53表达较弱；CHF组兔心肌细胞内有较多棕黄色颗粒，p53表达较强；辛伐他汀组兔心肌细胞内较少棕黄色颗粒沉积，p53表达较弱。正常对照组、CHF组和辛伐他汀组兔心肌细胞p53蛋白阳性表达率分别为(18.62±0.41)%、(45.39±0.68)%、(33.17±0.52)%；CHF组和辛伐他汀组兔心肌细胞p53蛋白阳性表达率高于正常对照组，差异有统计学意义(t=6.325、2.981，P<0.05)；辛伐他汀组兔心肌细胞p53蛋白阳性表达率低于CHF组，差异有统计学意义(t=3.256，P<0.05)。

A：正常对照组；B：CHF组；C：辛伐他汀组。

图2 3组兔心肌细胞中p53蛋白阳性表达(免疫组织化学染色，×200)

Fig.2 Positive expression of p53 protein in myocardial cells of rabbits in the three groups (immunohistochemical staining,×200)

3 讨论

CHF是一种复杂的临床综合征，心室重构、心肌细胞凋亡等一系列病理生理改变参与了CHF的发生和发展过程。细胞凋亡又称程序性细胞死亡，是组织细胞在正常生长发育过程中或在病理条件下的一种主动性死亡方式。目前认为，在心力衰竭的发病机制中，心肌细胞进行性死亡和丢失可能是导致心力衰竭恶化的主要原因之一[7]。凋亡导致心肌细胞缺失，心肌细胞数量减少使残留心肌细胞负荷加重，引起心肌收缩力进行性下降，心功能受损[8-9]。Fas基因表达I型膜受体蛋白，属肿瘤坏死因子受体家族成员之一[10]，Fas基因结构中有死亡信号所需的结构域，与Fas基因介导的细胞凋亡有关。细胞膜表面FasL蛋白阳性细胞可与Fas蛋白阳性表达细胞相互作用，将“死亡信号”传递给Fas蛋白阳性细胞，并激活该细胞的凋亡程序，继而于数小时内诱发细胞凋亡。细胞膜表达有功能的Fas蛋白，而且表达量达到一定强度是通过Fas途径诱导凋亡的首要条件。Fas调节心肌细胞凋亡的重要基因，也是调控凋亡信号途径的重要基因，sFas是Fas基因突变后的表达产物，以可溶性形式出现于外周血液中，检测血清sFas水平可以了解心肌细胞凋亡程度及心力衰竭严重程度[11]。p53依赖活化的核转录因子-κB诱导心肌细胞凋亡，阻断核转录因子-κB可以减少心肌细胞p53的表达，从而抑制心肌细胞凋亡[12]。p53在阿霉素诱导的心力衰竭大鼠心肌组织中表达和活性増高[13]。正常心肌细胞中p53蛋白表达极少，当各种原因导致DNA损伤时p53的转录水平升高，DNA修复启动，若DNA修复出现异常则诱导心肌细胞进入程序性凋亡[14]。阿霉素可直接导致DNA损伤，使p53表达增加，通过p53磷酸化增加而激活内源性凋亡途径[15]。本研究结果显示，CHF组兔血清sFas水平高于正常对照组，而辛伐他汀组兔血清sFas水平低于CHF组，提示辛伐他汀预处理可以显著减少心肌细胞凋亡。CHF组兔心肌细胞中p53蛋白表达高于正常对照组，而辛伐他汀组兔心肌细胞中p53表达低于CHF组，提示辛伐他汀能够抑制p53蛋白表达，通过干预细胞凋亡程序而抑制心肌细胞凋亡的发生，达到保护心肌作用，改善心功能。

左心室重构是CHF发展过程中的重要决定因素，目前，血管紧张素转换酶抑制剂、血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂、β受体阻滞剂及醛固酮受体拮抗剂等已被证实可以逆转心室重构，是心力衰竭的基本治疗药物。目前，辛伐他汀对CHF的有益作用越来越受到关注。有研究发现，辛伐他汀能够抑制CHF幼兔心肌细胞凋亡，从而保护心功能[16]。本研究结果显示，CHF组兔LVESD、LVEDD显著大于正常对照组，LVEF和LVFS显著低于正常对照组，提示CHF造模成功；与CHF组比较，辛伐他汀组兔LVESD、LVEDD减小，LVEF、LVFS升高，提示辛伐他汀可以减小LVESD、LVEDD，提高LVEF和LVFS，改善心室重塑及心功能。

综上所述，辛伐他汀可以显著改善CHF兔的心功能，抑制心室重构，其机制可能与其抑制Fas/FasL信号系统及心肌细胞凋亡有关。