三相萃取法提取白牛肝菌多糖的工艺研究

赵艳霞，王大红

（武汉职业技术学院生物工程学院，湖北武汉430074）

白牛肝菌，又称美味牛肝菌，是一种味道鲜美、肉厚而细软的优良野生食用菌[1]。白牛肝菌富含蛋白质、维生素、多糖、氨基酸和各种矿质元素，其中白牛肝菌多糖是一类含有多种活性物质的大分子化合物，是由醛糖和酮糖以吡喃糖苷键连在一起的多聚物。研究表明白牛肝菌多糖可以提高机体的耐力，具有抗疲劳、抗氧化的功效[2-4]。因此开展与白牛肝菌及其提取物相关的研究，对其进一步的开发、推广利用有着深远的意义。

目前，多糖的传统提取工艺为乙醇沉淀法[5-7]，此方法虽然能提取出大量的多糖，但是存在提取不彻底，原料利用率低，乙醇用量大等问题。三相萃取法提取多糖可以避免醇沉工艺的缺点，其原理是通过在水提液中加入无机盐和有机溶剂使其形成三相，上相为有机层，主要是吸附色素、脂类等极性较小的物质，中间相为盐析形成蛋白质层，下相为水层，主要是溶解一些水溶性物质[8-10]。提取结束后，提取液中的有机溶剂和无机盐都可回收，是一种绿色高效提取多糖的工艺。本试验采用叔丁醇-（NH4）2SO4-提取液三相体系萃取白牛肝菌多糖，并通过响应面试验优化提取工艺，并分析白牛肝菌多糖的抗氧化活性，为白牛肝菌的提纯和开发利用提供科学的参考依据，能让其发挥最大的市场经济价值。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

RV10 型旋转蒸发仪：德国 IKA 公司；LD-10 型冷冻干燥机：湖南博瑞德生物有限公司；YT-1 型分光光度计：无锡尚科仪器有限公司；TENSOR II 傅里叶变换近红外光谱仪：德国Bruker Optics 公司。

1.2 材料与试剂

试验白牛肝菌：当地药材市场。无水乙醇、叔丁醇、（NH4）2SO4均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 白牛肝菌多糖三相萃取工艺流程

白牛肝菌→蒸馏水提取→水提液浓缩→加入（NH4）2SO4、叔丁醇→混匀→静止萃取→分离、冷冻干燥→白牛肝菌多糖

1.3.2 白牛肝菌多糖三相萃取工艺要点

1）蒸馏水提取：将10 g 白牛肝菌按料液比1 ∶30（g/mL）加入蒸馏水，50 ℃水浴 30 min，提取 1次～4 次。

2）水提液浓缩：将提取液在50 ℃条件下旋转蒸发，浓缩至100 mL。

3）加入（NH4）2SO4、叔丁醇：在提取液浓缩中加入10%～50%添加量的（NH4）2SO4，再加入 5 mL～25 mL 的叔丁醇，形成三相体系。

4）混匀、静止萃取：充分混匀后，于 20 ℃～60 ℃条件下静置萃取60 min。

5）分离、冷冻干燥：萃取后，形成三相，上层为叔丁醇相，主要含有色素、脂类物质、黄酮类；中间相为蛋白质；下层为（NH4）2SO4相，主要含有白牛肝菌多糖，并通过分子透析法除去无机盐后冷冻干燥得到白牛肝菌多糖。

1.3.3 白牛肝菌多糖提取率的计算

采用苯酚-硫酸法测多糖含量[11-14]，以外标法测定白牛肝菌多糖质量，并计算得到多糖提取率，计算公式如下：

白牛肝菌多糖提取率/%=（白牛肝菌多糖质量/白牛肝菌样品质量）×100

1.3.4 单因素试验

称取10 g 白牛肝菌，以水提法分别提取1、2、3、4次，合并提取液浓缩至100 mL，以三相萃取法提取白牛肝菌多糖，提取浓缩并冷冻干燥后制得白牛肝菌多糖，测定白牛肝菌多糖含量并计算提取率。分别研究（NH4）2SO4添加量 10%、20%、30%、40%、50%，叔丁醇添加量 5、10、15、20、25 mL，萃取温度 20、30、40、50、60 ℃条件下，对白牛肝菌多糖提取率的影响。

1.3.5 响应面试验对白牛肝菌多糖提取条件的优化

根据单因素试验得到的结果，选取（NH4）2SO4添加量、叔丁醇添加量、萃取温度3 个因素，采用Designexpert8.0 软件进行响应面试验设计[15-19]，试验因素与水平见表1。

1.3.6 白牛肝菌多糖清除·OH 能力的测定

参照水杨酸法[20]，分别取 0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mg/mL白牛肝菌多糖溶液各2 mL 置于10 mL 的试管中，再加入 2 mL 硫酸亚铁（0.005 moL/mL）、2 mL H2O2，静置5.0 min 后，再加入 2 mL 的水杨酸溶液（0.005 moL/mL），在37 ℃温度下水浴10 min，波长510 nm 条件下测定吸光度X 值。X0为空白对照组的吸光度值，X1为蒸馏水代替白牛肝菌多糖溶液的吸光度值，X2为白牛肝菌多糖溶液的吸光度值，并以VC作为对照组，·OH 清除率计算公式如下所示：

表1 响应面试验因素水平Table 1 The level of response surface experimental factors

1.3.7 白牛肝菌多糖清除DPPH·能力的测定

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 （NH4）2SO4添加量对白牛肝菌多糖提取率的影响

（NH4）2SO4添加量对多糖得率的影响见图1。

图1 （NH4）2SO4 添加量对多糖得率的影响Fig.1 Effect of（NH4）2SO4 addition on extraction efficiency of polysaccharide

由图1 可知，开始随着（NH4）2SO4添加量从 10%增加到30 %时，白牛肝菌多糖的提取率在增加，由35.5%增加至40.9%，这可能是NH4+和SO4+可以稳定大分子间的相互作用，使萃取体系更加稳定，多糖能更好地溶解在溶剂中；当（NH4）2SO4添加量增加到40%及以后，白牛肝菌多糖的提取率呈减少趋势，这是由于盐浓度过高会使多糖和水分子之间的氢键作用力被减弱，从而降低了多糖的提取率，因此初步选择（NH4）2SO4添加量为 10%～30%之间。

2.1.2 叔丁醇添加量对白牛肝菌多糖提取率的影响

叔丁醇添加量对多糖得率的影响见图2。

图2 叔丁醇添加量对多糖得率的影响Fig.2 Effect of tert butyl alcohol addition on extraction efficiency of polysaccharide

由图2 可知，随着叔丁醇添加量的增加，白牛肝菌多糖的提取率也相应增加，在叔丁醇添加量在5 mL～10 mL 之间，白牛肝菌多糖提取率增加幅度较大，这可能是由于增加叔丁醇和（NH4）2SO4的含量引起相互作用的结果，导致多糖提取率的增加；但是当叔丁醇添加量超过15 mL 后，白牛肝菌多糖的提取率大幅下降，这可能是叔丁醇的含量过高不利于三相体系的稳定性，所以初步选择白牛肝菌多糖的叔丁醇添加量在5 mL～15 mL 之间。

2.1.3 萃取温度对白牛肝菌多糖提取率的影响

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萃取温度对多糖得率的影响见图3。

图3 萃取温度对多糖得率的影响Fig.3 Effect of temperature on extraction efficiency of polysaccharide

由图3 可知，当白牛肝菌多糖萃取温度在20 ℃～40℃之间逐渐增加时，白牛肝菌多糖的提取率由34.3%增加至41.5%，这可能是因为温度的增加让三相萃取溶液体系中分子热运动加快，这样白牛肝菌多糖更容易从白牛肝菌中进入到萃取溶液中，从而白牛肝菌多糖的提取率增加；当萃取温度超过40 ℃以后，白牛肝菌多糖的提取率出现下降，这可能温度增加超过一定范围后，虽然多糖分子的热运动速度增加了，但是与其他物质间的反应以及反应速率也在增加，提取出的白牛肝菌多糖颜色也在加深，说明高温对白牛肝菌多糖的活性也有影响，所以选择提取温度20 ℃～40 ℃进行响应面优化试验。

2.1.4 水提次数对白牛肝菌多糖提取率的影响

水提次数对多糖得率的影响见图4。

图4 水提次数对多糖得率的影响Fig.4 Effect of extraction times on extraction efficiency of polysaccharide

由图4 可知，蒸馏水提次数对白牛肝菌多糖的提取率影响不大，在提取1 次～4 次范围内，多糖提取率都在42%左右波动。提取1 次时，多糖提取率最低，为41.6%；提取4 次时，多糖提取率最高，为42.1%，两种之间相差不大。从节约和经济的角度考虑，将提取次数定为1 次，考虑到提取次数对白牛肝菌多糖提取影响不明显，故而在响应面试验中提取次数不作为考察因子进行考虑。

2.2 响应面优化试验

响应面试验结果见表2。

表2 响应面分析方案和结果Table 2 Program and results of orthogonal test

续表2 响应面分析方案和结果Continue table 2 Program and results of orthogonal test

由Design-Expert 软件处理数据，方差分析结果见表3。对响应值与各个因素进行回归拟合，该模型对应的回归方程：Y=43.4+1.6A+1.8B+1.2C-0.83AB-1.48AC-0.33BC-2.14A2-7.79B2-4.24C2

回归方程各项的方差分析见表3。

表3 回归方程各项的方差分析Table 3 Analysis of variance for the fitted regression model

由表3 结果可知，整体模型P 值＜0.01，说明此时回归方差模型极显著，该试验方法可靠。方程失拟项也极显著，该回归模型与实测值能较好的拟合。其中A（NH4）2SO4添加量，B 叔丁醇添加量对响应值影响显著（P＜0.05），B2，C2对响应值影响极显著（P＜0.01），各个因素对白牛肝菌多糖得率影响大小顺序依次为：叔丁醇添加量（B）＞（NH4）2SO4添加量（A）＞萃取温度（C）。

2.3 响应面直观分析

Design-Expert 处理得到响应面的分析结果见图5～图7。

图5 （NH4）2SO4 添加量和叔丁醇添加量对多糖提取率影响的响应面图Fig.5 Response surface methodology for the influence of（NH4）2SO4 addition and tert butyl alcohol addition to materialratio on extraction rate of polysaccharides

图6 萃取温度和（NH4）2SO4 添加量对多糖提取率影响的响应面图Fig.6 Response surface diagram of the effect of temperature and（NH4）2SO4 addition on the extraction rate of polysaccharides

图7 萃取温度和叔丁醇添加量对多糖提取率影响的响应面图Fig.7 Response surface methodology for the influence of temperature and tert butyl alcohol addition to material ratio on extraction rate of polysaccharides

结果如图5、图6、图7 所示，响应面的直观分析得到的白牛肝菌多糖最佳提取条件为：（NH4）2SO4添加量30%，叔丁醇添加量10.3 mL，萃取温度36.8 ℃，理论提取率能达到45.92%。但是考虑到试验条件的可操作性，将提取条件设定为（NH4）2SO4添加量30%，叔丁醇添加量10 mL，萃取温度37 ℃，按试验步骤进行验证试验得到的白牛肝菌多糖提取率为47.3%，与上述最优值46.4%吻合程度较高，说明了模型的可靠性，证明用响应面优化白牛肝菌多糖提取方案具有一定的实际应用价值。

2.4 红外光谱

白牛肝菌多糖的红外光谱图，见图8。

图8 白牛肝菌多糖的红外光谱图Fig.8 The infrared spectrogram of Boletus boletus polysaccharides

白牛肝菌多糖的红外光图谱显示，在3 420 cm-1附近的强吸收峰是糖类分子间或分子内的O-H 键伸缩振动，在1 612 cm-1附近为羧基的C=O 伸缩振动，1 073 cm-1附近的强吸收峰是糖苷键C-O-C 非对称伸缩振动，属于吡喃环上的醚键特征吸收峰，说明白牛肝菌多糖中存在吡喃糖苷键。

2.5 白牛肝菌多糖清除·OH以及DPPH·的能力

白牛肝菌多糖清除·OH 以及DPPH·的能力见图9～图10。

图9 白牛肝菌多糖对·OH 的清除作用Fig.9 Scavenging effect of Boletus boletus polysaccharide on·OH

图10 白牛肝菌多糖对DPPH·的清除作用Fig.10 Scavenging effect of Boletus boletus polysaccharide on DPPH·

由图9、图10 可知，白牛肝菌多糖对·OH 清除率以及DPPH·清除率随白牛肝菌多糖浓度增加而增大，这两种自由基清除率越高说明白牛肝菌多糖的抗氧化能力就越强，白牛肝菌多糖对·OH 的半数清除率IC50值为2.5 mg/mL，对DPPH·清除率的半数清除率IC50值能达到11.6 mg/mL，说明白牛肝菌多糖对羟基自由基以及DPPH·都有很强的清除能力，也说明此三相萃取法工艺能够很好地保存了白牛肝菌多糖的活性。

3 结论

本试验以白牛肝菌为原料，利用三相萃取法提取白牛肝菌多糖，优化提取工艺。经过单因素试验以及响应面试验优化后，最佳提取工艺为（NH4）2SO4添加量为30%，叔丁醇添加量为10 mL，萃取温度为37 ℃，提取次数1 次，此工艺条件下白牛肝菌多糖的提取率能达到47.3%。白牛肝菌多糖的·OH 和DPPH·清除能力试验表明，白牛肝菌多糖对两者均具有很强的清除能力，说明白牛肝菌多糖具有一定的抗氧化能力，三相萃取法工艺也很好地保存了白牛肝菌多糖的活性。这为以后将白牛肝菌多糖开发成为具有抗疲劳、抗氧化、增强免疫功能的保健功能食品，提供一定的科学依据和研究基础。