橡子壳斗提取工艺及其抗氧化性研究

任云，朱晓敏，李明清，朱金慧，王博

（1.邯郸学院化学化工与材料学院，河北邯郸056005；2.武安市第一人民医院，河北武安056300）

橡子壳斗是指栎属（Quercus Linn.），包括麻栎、栓皮栎、辽东栎等栎树，果实壳斗，亦称橡碗。橡子壳斗可提取色素并用于染色，早在明高濂《遵生八笺》中记载了制取橡子壳斗染液的方法，名为染宋笺色法：“取橡斗子一升，用四升水浸一伏时煎熬至二升止，听用”[1]。另据《全国中草药汇编》记载，麻栎、栓皮栎、辽东栎等栎树植物树皮、叶、果实、果壳、壳斗可入药内服或外用，主要作用为收敛、止血、止泻、止咳[2]。近期，周丹初步研究并报道了栓皮栎壳斗及果壳提取物化学成分及其对食源性致病菌的抑菌作用，结果表明壳斗正丁醇相和乙醇相提取物对金黄色葡萄球菌抑制作用最强，其次是对甲型副伤寒沙门氏菌抑制作用较强[3]。橡子壳斗资源丰富，但目前产业附加值有限。其生物活性、抗氧化性等研究鲜有报道，进一步系统深入的研究橡子壳斗提取工艺、化学成分及其活性，将有利于开发其在食品、药品等方面的利用[4]，提高资源综合利用价值。就提取工艺而言，传统提取工艺辅助超声、微波等现代技术可提高提取效率，郝乘仪等采用超声辅助提取了橡子单宁，结果橡子单宁的提取率达到93.67%[5]。较于微波辅助，超声辅助具有设备成本低、安全性高等特点，有潜在的工业化价值。本研究采用超声辅助乙醇提取工艺提取橡子壳斗，利用响应面法对提取工艺进行优化，确定最优工艺，同时对提取物的酸碱稳定性和抗氧化性、总还原力进行研究，为橡子壳斗在食品或化妆品领域的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 原料及试剂

橡子壳斗：市售；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼：上海如吉生物科技发展有限公司；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠：新乡市化学制剂厂；铁氰化钾：中国上海试剂一厂；三氯化铁：北京市朝阳区通惠化工厂。其他试剂均为市售分析纯。

1.1.2 试验仪器

KQ-500DB 数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；T6 紫外-可见分光光度计：北京普析通用仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 确定检测波长

橡子壳斗干燥，粉碎过80 目筛，备用。称取1 g 橡子壳斗粉，在料液比 1 ∶40（g/mL），溶剂浓度取 0 %、95%（乙醇水溶液的乙醇体积分数），提取时间40 min、提取温度50 ℃，固定超声功率500 W 条件下，制备壳斗提取物溶液，将提取液离心，上清液稀释至合适浓度，在200 nm～800 nm 范围内进行紫外光谱扫描，确定橡子壳斗提取物紫外检测波长。

1.2.2 单因素试验

分别精确称取1.0 g 橡子壳斗粉，采用单因素试验，针对影响因素料液比、溶剂浓度、提取时间、提取温度等进行试验。根据前期预试验结果，提取率正比于超声功率，因此固定超声功率500 W，超声功率不做为影响因素。所得提取液统一稀释至1 g/L 后测定330 nm 处吸光度，考察各影响因素对橡子壳斗提取溶液吸光度的影响。

1.2.3 响应面优化试验

根据单因素试验结果确定Box-Behnken 设计的自变量为提取温度、溶剂浓度、料液比，自变量取值见表1。

表1 响应面试验因素及水平Table 1 Response surface test factor level

进行三因素三水平响应面优化17 组试验，并重复试验3 次取平均值，其他条件同单因素试验。根据响应面试验结果，以得到提取液330 nm 处吸光度为响应值，采用Design expert 程序对所得数据进行处理，得到二次回归方程和误差分析。确定最优工艺条件及其提取液吸光度的预测值，并进行验证试验[6]。

1.2.4 提取物表征

1.2.4.1 pH 值对提取液稳定性影响

取6 份10 mL 0.3 g/L 橡子壳斗提取物配置的溶液，分别用盐酸或氢氧化钠将 pH 值调至 2、4、6、8、10、12，静置60 min 后对各溶液以及对照液进行330 nm检测波长的吸光度测定。以是否产生沉淀、严重褪色评价其稳定性。

1.2.4.2 金属离子对提取液稳定性影响

取8 份25 mL0.3 g/L 橡子壳斗提取物配置的溶液，分别加入不同的金属离子，K+、Ca2+、Na+、Mg2+、Zn2+、Cu2+、A13+、Fe3+，且浓度均为 0.05 mol/L，室温 20 ℃避光放置24 h 后对各溶液以及原提取液进行紫外光谱分析。

1.2.4.3 DPPH 自由基清除能力

橡子壳斗提取物及VC，配制浓度分别为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 g/L 的溶液。

样品组中，分别取不同浓度的橡子壳斗溶液5 mL，加入0.2 mmol/L 的DPPH 溶液5 mL，摇匀，放置于阴凉避光处，30 min 后以无水乙醇为对照，在517 nm 处测定吸光度A0[7]。VC同上。

空白组中，分别取不同浓度的橡子壳斗溶液5 mL，加入无水乙醇5 mL，以无水乙醇为对照，在517 nm 处测定吸光度A1。VC同上。

对照组中，取0.2 mmol/L 的DPPH 溶液5 mL，加入无水乙醇5 mL，以无水乙醇为对照，在517 nm 处测定吸光度A2。

按下列公式计算DPPH 自由基清除率[8]：

DPPH 自由基清除率/%=[1-（A0-A1）/A2]×100

1.2.4.4 总还原能力的测定

橡子壳斗提取物、VC分别配制浓度为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 g/L 的溶液。

分别取不同浓度的橡子壳斗溶液2.5 mL，加入0.2 mol/L pH6.6 的磷酸盐缓冲溶液2.5 mL，1%的铁氰化钾溶液2.5 mL，摇匀，放置于50 ℃水浴反应，20 min后快速冷却，加入10%的三氯乙酸溶液2.5 mL，摇匀后以3 000 r/min 离心10 min，取上清液，加入1 g/L的三氯化铁溶液2.5 mL，摇匀后室温20 ℃静置反应，10 min 后，在 700 nm 处测定吸光度。以 VC为对照[9]。

1.3 数据处理

根据响应面试验结果，以得到提取液吸光度为响应值，采用Design expert v8.0.6 程序对所得数据进行处理，得到二次回归方程、误差分析和各影响因素之间交互影响图，筛选出最优工艺条件以及该条件下提取液吸光度预测值。

2 结果与讨论

2.1 确定检测波长

橡子壳斗提取液进行稀释，稀释后料液比1 g/L，在200 nm～800 nm 波段进行图谱扫描，结果如图1 所示。

图1 橡子壳斗提取物全波长扫描Fig.1 Full wavelength scanning of acorn shell extract

如图1 所示，水或乙醇提取物吸收峰均出现在200 nm～400 nm，且吸收曲线具有相同变化趋势，说明两种溶剂提取物组成相同。尤其在330nm～500nm 处，两曲线重合，因此选用330 nm 作为检测波长，测定壳斗提取物的吸光度，以量化提取率。

2.2 单因素试验

2.2.1 溶剂浓度对橡子壳斗提取物溶液吸光度的影响

在固定料液比为 1 ∶40（g/mL）、提取时间为 40 min、提取温度为50 ℃，改变溶剂浓度分别为30%、40%、50%、60%、70%，结果如图2 所示。

图2 溶剂浓度对橡子壳斗提取物溶液吸光度的影响Fig.2 Effect of solvent concentration on the absorbance of acorn shell extract

由图2 可知，随着溶剂浓度增加，壳斗提取液的吸光度先增大，增大到一定值后，随着溶度浓度的增加而减小，在溶剂浓度为50%时有最高点。溶剂浓度低，得到的橡子壳斗溶液吸光度低，即提取率低；溶剂浓度高，溶剂的极性不适合橡子壳斗的提取，得到的橡子壳斗溶液浓度低，且溶剂成本较高。因此选择合适的溶剂浓度对橡子壳斗的提取是有利的，由此确定最佳溶剂浓度为50%。

2.2.2 料液比对橡子壳斗提取物溶液吸光度的影响

在固定溶剂浓度为50%、提取时间为40 min、提取温度为 50 ℃，改变料液比（1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50、1 ∶60、1 ∶70 g/mL）条件下，结果如图3 所示。

图3 料液比对橡子壳斗提取物溶液吸光度的影响Fig.3 Effect of material-liquid ratio on the absorbance of acorn shell extract

由图3 可知，料液比增加，提取液的吸光度先增加后减小，但总体减小缓慢。当料液比在1 ∶40（g/mL）至1 ∶50（g/mL）之间时，应有最高点，因此综合考虑溶液成本与提取效率，选取最佳料液比为1 ∶40（g/mL），既可以减少成本，避免资源浪费，又能达到最大提取率。确定响应面试验水平料液比为1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50（g/mL）。

2.2.3 提取时间对橡子壳斗提取物溶液吸光度的影响

在固定溶剂浓度为50%、料液比为1 ∶40（g/mL）、提取温度为 50 ℃，改变提取时间 20、40、60、80、100 min条件下，结果如图4 所示。

图4 提取时间对橡子壳斗提取物溶液吸光度的影响Fig.4 Effect of extraction time on the absorbance of acorn shell extract

由图4 可知，提取液的吸光度随着提取时间的增加，先增加后减少，在提取时间为40 min 有最高点。超声辅助提取，可产生机械热效应和空化效应，使有效成分快速扩散到溶剂中，有效减少提取时间。当提取时间过长时，超声波可能破坏提取物结构，或可能使提取物产生团聚、絮凝使提取率降低。因此取40 min为单因素最优水平，由于过长时间超声的破坏作用，不选取提取时间作为响应面分析的因素。

2.2.4 提取温度对橡子壳斗提取物溶液吸光度的影响

在固定溶剂浓度为50%、料液比为1 ∶40（g/mL）、提取时间为 40 min，改变提取温度（40、50、60、70、80 ℃）条件下，结果如图5 所示。

由图5 可知，随着提取温度增加提取液的吸光度先增加，增加到一定值后，随着温度的增加而减小，在温度为70 ℃时有最高点。提取温度过高，提取物中的某些热敏物质可能被破坏，使得到的橡子壳斗溶液吸光度降低，具体机理有待进一步研究。综合考虑成本与提取率，60 ℃与70 ℃提取率相差较小，确定最佳提取温度为60 ℃。

2.3 响应面优化试验

2.3.1 响应面二次回归方程的建立与误差分析

响应面试验结果见表2。

表2 响应面试验结果Table 2 Results for response surface analysis

采用Design expert 程序对表2 数据用ANOVA进行回归分析，得到误差分析结果及二次回归方程见表3。

表3 响应面误差分析结果Table 3 Variance analysis of regression model

该模型的C.V.=1.62%，C.V.值越小说明模型的置信度就越高，说明该模型的置信度高。该模型的R2adj=0.969 7、R2=0.986 7，R2和 R2adj 越接近 1，说明模型相关性越好，表明提取液吸光度的影响96.97%来源于提取温度、溶剂浓度、料液比。该试验模型与试验实际过程符合程度高，模型合理可行，可用来预测试验中橡子壳斗提取液吸光度与试验过程各因素、各水平的相关变化关系。

吸光度=0.56-4.875×10-3×A-0.043×B-0.019×C+3.500×10-3×AB-0.020×AC+0.012×BC-0.040×A2-0.023×B2-0.035×C2

通过响应面误差分析，该模型P＜0.000 1 为极显著性差异，说明该模型显著性高。其中，溶剂浓度、料液比、AC、A2、B2、C2对提取液吸光度的影响极高度显著，其 P 值均＜0.01；BC 的影响显著，其 P 值＜0.05；提取温度、AB 对提取液吸光度影响不显著，其P 值均＞0.05。且影响由大到小因素顺序为：溶剂浓度＞料液比＞提取温度。失拟误差为0.056 5＞0.05 为不显著，说明实验结果影响因素都在考察范围之内，试验结果不受其他因素影响或可忽略[10]。

2.3.2 各影响因素交互作用

2.3.2.1 提取温度和溶剂浓度交互作用

交互作用响应面陡峭程度越高，代表交互作用越强。图6 为提取温度和溶剂浓度对橡子壳斗提取物溶液吸光度交互作用结果。

图6 提取温度和溶剂浓度响应面曲线Fig.6 Response surface curves of extraction temperature and solvent concentration

该响应面陡峭程度为3 个交互作用中程度最低，其交互作用对提取结果影响不显著。当提取温度一定时，溶液吸光度随着溶剂浓度减小缓慢增加，并逐渐趋于平缓。当溶剂浓度一定时，溶液吸光度随着提取温度增加，呈现先增加后减少趋势，且变化范围较小。

2.3.2.2 提取温度和料液比交互作用

图7 为提取温度和料液比对橡子壳斗色素提溶液吸光度交互作用结果。

图7 提取温度和料液比响应面曲线Fig.7 Response surface curves of extraction temperature and ratio of feed to liquid

该响应面陡峭程度为3 个交互作用中程度最高，交互作用对溶液吸光度影响显著。当提取温度为60 ℃、料液比为 1 ∶40（g/mL）时，吸光度最大，达提取最优点，相对于最优点，更高的温度和溶剂用量较更低的温度和溶剂用量提取率降低的更加快速，此提示橡子壳斗更适合在较少的溶剂用量下采用较低温度进行提取。

2.3.2.3 溶剂浓度和料液比交互作用

图8 为溶剂浓度和料液比对橡子壳斗提取物溶液吸光度影响的交互作用结果。

图8 溶剂浓度和料液比响应面曲线Fig.8 Response surface curves of solvent concentration and ratio of feed to liquid

该响应面陡峭程度为3 个交互作用的中间程度，交互作用对溶液吸光度影响显著。当溶剂浓度一定时，溶液吸光度随着溶剂用量增加先增加后减小，且变化范围较小。当料液比一定时，溶液吸光度随着溶剂浓度的增加，呈降低趋势，提示应选取较低的溶剂浓度。

2.3.3 响应面最优工艺筛选与验证

用Design expert 8.0.6 软件中Solutions 分析，得到超声辅助乙醇提取橡子壳斗的最优工艺为：提取温度60.09 ℃、溶剂浓度 40%、料液比 1 ∶35.5（g/mL），在最优条件下吸光度预测值为0.587。验证试验：提取温度60.0 ℃、溶剂浓度 40%、料液 1 ∶35.5（g/mL）、提取时间40 min 条件下进行试验得到提取液吸光度为0.586，与预测值相吻合。验证后确定超声辅助乙醇提取橡子壳斗最优工艺为：提取温度60.0 ℃、溶剂浓度40%、料液比 1 ∶35.5（g/mL）、提取时间 40 min。将最优工艺获得提取液于50 ℃常压干燥、研磨后获得粉状固体并称重，计算最优工艺下的提取率为26.3%，计算公式如下：提取率/%=[粉状固体质量（g）/橡子壳斗质量（g）]×100

2.4 提取物表征

2.4.1 pH 值对橡子壳斗提取液稳定性影响

不同pH 值调节下橡子壳斗提取液均未产生沉淀或浑浊，也未出现严重褪色。仅表现为颜色变化及检测波长下吸光度变化，具体影响见图9。

图9 pH 值对橡子壳斗提取物溶液吸光度的影响Fig.9 Effect of pH on absorbance of acorn shell extract solution

由图9 可知，在酸性条件下，吸光度减小，溶液颜色变浅呈黄色；在碱性条件下，溶液吸光度增长较明显，且溶液颜色加深至棕红色。表明酸、碱性环境对其组分均有影响，但在较宽范围内均表现稳定，不产生沉淀或变为无色。该提取物溶液随pH 越高吸光度越大且有颜色又黄变化为棕红，提示其用做色素具有潜在的应用价值。

2.4.2 金属离子对橡子壳斗提取液稳定性影响

金属离子的影响结果，见表4。

表4 金属离子对于橡子壳斗提取物溶液稳定性的影响Table 4 Effect of metal ions on the stability of acorn shell extract solution

由表4 可知，钠离子、钙离子、钾离子对于橡子壳斗提取物溶液的影响极小，几乎未改变其波谱性质，故对橡子壳斗提取物稳定性无影响；锌离子、镁离子并未大幅改变橡子壳斗提取物检测波长下的吸光度，但吸光度均有一定的上升或下降，都出现了少量黄色絮状沉淀。说明此两者对于橡子壳斗稳定性有一定程度的影响；铝离子使得吸光度有大幅度减少，故铝离子对于橡子壳斗溶液的稳定性有着较大影响；铁离子和铜离子，表现为使溶液产生黑绿色沉淀和黑色沉淀，且伴随着溶液颜色加深，故铁离子和铜离子对橡子壳斗提取物溶液稳定性有着极大的影响。

2.4.3 DPPH 自由基清除能力

橡子壳斗提取物对DPPH 自由的基清除能力结果见图10。

由图10 可知，DPPH 自由基的清除率随橡子壳斗的浓度升高而增大，且清除能力略低于VC。反应后的溶液有明显的颜色变化，且不同浓度溶液有明显的梯度变化。在浓度达到0.05 g/L 时，清除率已达到95 %。

图10 DPPH 自由基清除能力测定Fig.10 Free radical-scavenging activity on DPPH·

2.4.4 总还原能力的测定

橡子壳斗提取物总还原力测定结果见图11。

由图11 可知，橡子壳斗能使铁氰化钾的三价铁还原成二价铁（亚铁氰化钾），二价铁进一步在和FeCl3反应，生成在700 nm 处有最大吸光度的普鲁士蓝（Fe4[Fe（CN）6]3），且吸光度越高，待测物的还原力越强。橡子壳斗的总还原力大于VC。

图11 总还原力测定Fig.11 Determination of total reducing force

3 结论

采用超声辅助乙醇提取法对橡子壳斗进行提取，单因素试验得到影响橡子壳斗提取率的主要因素为：溶剂浓度、料液比、提取温度。更进一步，运用响应面优化法得到影响因素顺序：溶剂浓度＞料液比＞提取温度，及二次回归模型为：

吸光度=0.56-4.875×10-3×A-0.043×B-0.019×C+3.500×10-3×AB-0.020×AC+0.012×BC-0.040×A2-0.023×B2-0.035×C2

最终确定了最优工艺为提取温度60.0 ℃、溶剂浓度 40%、料液比 1 ∶35.5（g/mL），在最优条件下提取物溶液吸光度预测值为0.587，验证试验溶液实际吸光度为0.586，与预测值吻合。且在最优工艺下的测得提取率为26.3%。表征了提取物的稳定性、抗氧化性、总还原力，结果为：橡子壳斗提取物在酸性环境中检测波长下吸光度减小，溶液呈黄色；碱性环境中，吸光度增加，颜色加深，呈棕红色。K+，Na+，Ca2+对提取物溶液无影响；Mg2+，Zn2+对提取物溶液影响较小，形成少量絮状沉淀；Fe3+，Cu2+，Al3+，易与提取物络合形成沉淀，溶液吸光度减小明显。提取物对DPPH 自由基的清除率略低于VC；铁离子总还原力略高于VC，具有一定的抗氧化性。

综上可见，橡子壳斗提取物得率可观，为其进一步开发利用奠定了物质基础。提取物表现为棕色，可作为棕色素应用于食品、化妆品、药品的染色调色方面；其对常见离子表现稳定，可以配置成溶液使用，调整溶液pH 值可调节颜色呈黄色至棕红色变化，有交宽pH 值使用范围。该提取物具有一定的抗氧化、抗自由基作用，应用于食品提供染色的同时可起一定抗氧化作用，延缓食品的氧化变质，具有一定的开发利用价值。