枸杞黄酮超声波辅助提取工艺优化及枸杞品质综合判定

刘元林，龙鸣，田晓静，，*，张福梅，陈士恩，马忠仁，，诺茹·伊扎·诺丁

（1.西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃兰州730124：2.西北民族大学生物医学研究中心中国-马来西亚国家联合实验室，甘肃兰州730030；3.马来西亚标准与工业研究所工业生物技术研究中心，雪兰莪州莎阿南新区40700）

我国枸杞资源丰富，共有7 个品种和3 个变种，主要分布在西北地区[1]。枸杞具有滋补作用，可入药，现代医学表明：枸杞具有降血糖、抗肿瘤、免疫调节、补肾、抗氧化、抗辐射、降血压、抗衰老、抗疲劳、保肝、明目等功效[2]。枸杞黄酮具有多种保健作用[3-6]，如何从植物中提取纯度高、活性高的黄酮类物质，将黄酮进一步加工成具有抗癌、抗衰老、调节内分泌等功能的保健食品成为热点。目前黄酮提取方法主要为有机溶剂提取法[7]、超声波法[8-9]、微波辅助酶法[10]、酶解法等[11]；黄酮含量检测方法有分光光度法[12]、色谱法[13]、薄层色谱法等[14-15]。目前对枸杞黄酮研究主要在提取工艺的比较与优化方面，通过分析枸杞黄酮含量判定枸杞品质的研究较少。

本文通过对比分析超声波提取法、乙醇浸提法以及酶提法提取枸杞黄酮的效果，得出较佳提取方法，在此基础上，采用单因素试验研究超声波功率、超声时间以及乙醇浓度3 个因素对黄酮提取的影响规律，再采用三因素三水平正交试验优化超声波提取工艺。在优化提取条件下，结合显著性分析和主成分分析研究不同产地、品种枸杞黄酮提取率的差异，为监督市场枸杞的品质提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

不同产地、品种枸杞样品购于宁夏中宁市场信息见表1 与表2，15 种市售枸杞样品信息见表3，样品购回后置于-4 ℃冷藏待用。

722E 型可见分光光度计：上海光谱仪器有限公司；KQ2200DE 数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；SXT-06 索式提取器：上海洪纪仪器设备有限公司；H2050R 台式高速冷冻离心机：长沙湘仪离心机器有限公司；DG120 型中药材粉碎机：浙江省瑞安寿海药材器械厂；CR-10 便携式积分球分光光度仪（色差计）：日本Konica Minolta 公司。

表1 不同地区枸杞样品信息表Table 1 Sample information of Lycium barbarum L.from different regions

表2 不同品种枸杞样品信息表Table 2 Sample information of Lycium barbarum L.of different varieties

表3 15 种市售枸杞样品基本信息表Table 3 Sample information of 15 comercially avaiable Lycium barbarum L.

芦丁：合肥博美生物科技有限责任公司；石油醚、无水乙醚、亚硝酸钠、氢氧化钠：天津市百世化工有限公司；果胶酶（10 000 U/g）：东莞市瓦里西化工有限公司；药品均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 样品预处理

将枸杞洗干净，置于55 ℃烘箱干燥至恒重后粉碎，以密封袋密封，置于-4 ℃冷藏待用。

1.2.2 黄酮提取率测定

参照刘景煜等[16]所用方法，采用分光光度计法测定枸杞黄酮含量。以吸光度为纵坐标，芦丁浓度为横坐标，绘制出标准曲线。用最小二乘法作线性回归，可以得出芦丁浓度C（μg/mL）与吸光度A 的关系曲线，回归方程式：A=0.003 9C+0.005 8，R2=0.993 1，在 0～110 μg/mL区间有较好的线性相关性。

式中：A 为由标准曲线算得被测液中黄酮含量，μg；M 为试样质量，g；V1为测定用试样体积，mL；V2为试样定容体积，mL。

1.2.3 单因素试验

参照枸杞黄酮提取[17-19]文献，采用乙醇浸提法、超声波提取法、酶提取法提取枸杞黄酮，对比分析获得较佳的提取方法。在此基础上，以枸杞黄酮提取率为指标，通过单因素试验研究超声功率（60、70、80、90、100 W）；提取时间（10、15、20、25、30 min）；乙醇浓度（55%、65%、75%、85%、95%）对枸杞黄酮提取率的影响规律。

1.2.4 正交试验

在单因素试验基础上，采用三因素三水平正交试验优化提取工艺，进行L9（34）正交试验，其因素水平设计表见表4。

表4 正交试验因素水平表Table 4 Orthogonal test factors and levels

1.2.5 基本物理参数测定

参照 GB/T18672-2014《枸杞》[20]和 SN/T0878-2000《进出口枸杞检验规程》[21]，采用称量方法测定百粒重；结合称量与计数测量粒度；使用游标卡尺测量枸杞长轴长和短轴长；采用色差计测量a*、b*、L*。每个参数重复检测3 次，以其平均值进行后续分析。

1.2.6 粗脂肪含量的测定

参照卫斌颉[22]的方法测定枸杞脂肪。

1.3 数据处理

采用显著性分析（significance test）与主成分分析（principle component analysis，PCA）对不同产地、品种和市售枸杞进行定性判别；试验数据采用SAS 8.0 软件（美国SAS 软件公司）进行数据分析，试验结果图由Origin 8.0 软件（美国 OriginLab 公司）绘制。

2 结果与分析

2.1 3种提取方法比较

3 种提取方法结果见图1。

图1 3 种提取方法结果比较Fig.1 The results of three extraction methods are compared

由图1 可知，超声波提取法黄酮提取率显著高于其他两种方法，乙醇浸提法与酶提取法黄酮提取率差异不显著，与韩秋菊等[17]结果一致，故超声波提取法提取效果更佳。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 超声功率与黄酮提取率的关系

超声功率对枸杞黄酮提取率的影响见图2。

图2 超声功率对枸杞黄酮提取率的影响Fig.2 Effect of Ultrasonic power on the extraction rate of flavone in Lycium barbarum L.

由图2 可知，在料液比为 1 ∶30（g/mL）、乙醇浓度为85 %、提取温度为80 ℃、提取时间为15 min、提取2 次的条件下，发现枸杞黄酮提取率随着超声功率升高而上升，当超声功率到达80 W 时，提取率随超声功率升高而降低，可能是功率过大造成温度上升，在一定程度上破坏黄酮提取物或使乙醇挥发，故提取枸杞黄酮较佳超声功率为80 W。

2.2.2 乙醇浓度与黄酮提取率的关系

乙醇浓度对枸杞黄酮提取率的影响见图3。

图3 乙醇浓度对枸杞黄酮提取率的影响Fig.3 Effect of Ethanol concentration on the extraction rate of flavone in Lycium barbarum L.

由图3 可知，在料液比为 1 ∶30（g/mL）、超声功率为80 W、提取温度为80 ℃、提取时间为15 min、提取2 次的条件下，枸杞黄酮提取率随乙醇浓度升高而上升，乙醇浓度为85%时枸杞黄酮提取率最大，超过85%时枸杞黄酮提取率反而变小，故较佳乙醇浓度为85%。

2.2.3 超声时间与黄酮提取率的关系

超声时间对枸杞黄酮提取率的影响见图4。

图4 超声时间对枸杞黄酮提取率的影响Fig.4 Effect of Ultrasonic time on the extraction rate of flavone in Lycium barbarum L.

由图4 可知，在料液比为 1 ∶30（g/mL）、超声功率为80 W、提取温度为80 ℃、乙醇浓度为85 %、提取2次的条件下，随超声时间延长枸杞黄酮提取率先上升后下降，在提取时间为25 min 时最大，30 min 时提取率下降，可能是时间过长黄酮提取物发生一定程度水解，故提取枸杞黄酮较佳超声时间为25 min。

2.3 正交试验结果

以超声功率、乙醇浓度、超声时间为因素，以黄酮提取率为指标，采用三因素三水平正交试验优化，其设计表和结果见表5。

表5 正交试验结果表Table 5 Orthogonal test results table

由表5 可知，根据极差分析影响顺序为B＞A＞C，即乙醇浓度对枸杞黄酮的提取效果影响最为显著，其次为超声功率，最后为超声时间。较佳提取条件为A3B2C2，即超声功率90 W、乙醇浓度85 %、超声时间25 min，提取2 次，此时枸杞黄酮提取率为2.267%。该结果与韩秋菊等[17]结果接近，但本研究各参数均略高于文献报道，同时黄酮提取率也略高。

2.4 不同产地枸杞品质差异分析

不同产地枸杞主成分分析结果见图5。

图5 不同产地枸杞主成分分析结果Fig.5 Results of principal component analysis of Lycium barbarum L.in different habitats

由图5 可知，以不同产地枸杞物理参数和黄酮提取率进行主成分分析时，第1 主成分为45.54%，第2主成分为21.60%，累积贡献率为67.14%，基本可以代表枸杞的原始信息。不同产地枸杞物理指标存在一定的差异性，宁夏产的枸杞粒度较大，粒子小且轻，a*、b*与其他地区差异显著、宁夏枸杞位于最右方；甘肃瓜州枸杞百粒重与粒度在青海与宁夏中宁枸杞样品之间、甘肃瓜州与青海产的枸杞a*、b*差异不显著，甘肃瓜州枸杞位于中间；青海产枸杞粒子大且重，青海枸杞位于左方。宁夏中宁、甘肃瓜州、青海产的枸杞中的黄酮提取率、百粒重、粒度差异显著，3 种产地分离效果较好，这与刘晓慧等[23]、张波等[24]结果一致，以基本物理指标与黄酮提取率为输入，采用主成分分析实现了不同产地有效的区分。

2.5 不同品种枸杞品质差异分析

不同品种枸杞主成分分析结果见图6。

图6 不同品种枸杞主成分分析结果Fig.6 Results of principal component analysis of different varieties of Lycium barbarum L.

由图6 可知，以不同品种枸杞物理参数和黄酮提取率进行主成分分析时，第1 主成分为72.89%，第2主成分为20.65%，总贡献率达93.54%，代表了原始数据的很大部分信息。中宁枸杞、新品种5 号与小颗粒3 个品种百粒重、粒度、横纵轴、色差、黄酮提取率都存在显著差异，粒度与黄酮提取率小颗粒显著高于其他两个品种，百粒度、横纵轴小颗粒显著低于其他两个品种，就色差而言小颗粒b*最大，故小颗粒品种分布在右侧，其他样品分布在左侧，不同样品彼此分离，且不同产地枸杞组间彼此区分，能实现3 个不同品种枸杞的区分。这与述小英等[25]以主成分和聚类分析对不同品种枸杞果实功能营养成分的区分结果一致。

2.6 市售枸杞品质差异

对15 种市售枸杞的百粒重、粒度、长短轴、脂肪含量、黄酮提取率进行检测，结果见表6。

从表6 中可知，15 种枸杞的黄酮提取率差异显著，但宁夏中卫的NA 与QY 黄酮提取率差异不显著；宁夏银川的HM 与QL 黄酮提取率差异不显著；新疆的HL 与宁夏中卫的TZ 与YC 黄酮提取率差异不显著；长短轴部分市售枸杞差异不显著；百粒重、粒度、脂肪含量15 种市售枸杞差异性显著。

15 种市售枸杞主成分分析结果见图7。

由图7 可知，以15 种市售枸杞物理参数和黄酮提取率为参数进行主成分分析时，第1 主成分为66.24%。第2 主成分为21.00%，总贡献率达87.24%，代表了原始数据大部分信息。青海产枸杞（YCT、QH）与新疆产枸杞HL 跟其他产地枸杞分离；宁夏地区中卫、中宁与银川产的枸杞不易区分开；陕西咸阳产的XY 与宁夏产枸杞不易区分开，原因可能为两产地距离相对其他地区近，由此能实现市售枸杞的区分，这与2.4 中不同产地主成分分析结果一致。

表6 市售枸杞的基本参数Table 6 The basic parameters of Lycium barbarum L.

图7 市售枸杞主成分分析结果Fig.7 The analysis results of the main components of Lycium barbarum L.

3 结论

研究发现，对枸杞黄酮提取而言，超声波提取法优于乙醇浸提法和酶提取法。采用三因素三水平正交试验优化超声波提取法工艺条件，获得较佳的提取条件为A3B2C2，即浓度为85%乙醇，超声波功率为90 W，提取时间为每次25 min，提取次数2 次时，此时枸杞黄酮提取率为2.267%。在优化的条件下，研究不同产地、品种枸杞样品及15 种市售枸杞黄酮含量差异，发现不同产地、品种枸杞黄酮含量存在显著性差异，甘肃产枸杞黄酮含量显著高于宁夏与青海产枸杞；宁夏小颗粒枸杞黄酮含量高于新品种5 号与中宁枸杞；对市售枸杞，黄酮提取率差异性显著，但部分品牌枸杞间黄酮提取率差异性不显著；主成分分析结果表明枸杞物理参数和黄酮提取率可实现对不同产地、品种和市售枸杞样品的区分。