桑黄子实体多糖超声波微波协同辅助提取及活性研究

应瑞峰，黄梅桂，王耀松，吴彩娥，李婷婷，范龚健

（南京林业大学轻工与食品学院，江苏南京210037）

桑黄主要寄生在桑树上，它是一种真菌，有些地方也叫作桑臣、桑耳或鲍氏层孔菌，并且有着黄褐色的子实体，因而得名。桑黄在分类上属于担子菌门、锈荸孔菌科、针层孔菌属。在我国桑黄主要寄生于杨树、松树、柳树、杜鹃等树的树干上，桑黄分布比较广泛，主要集中分布在我国东北、西北、华北等地，尤其在原始森林中。桑黄早在2000 多年前，记载桑黄用作昂贵的中药，其最大的特点就是：桑黄具有非常突出的调节机体免疫，延缓衰老和抗肿瘤的效果[1-2]。桑黄子实体具有很好的抗肿瘤效果，很多研究结果表明，桑黄提取物能有效抑制肿瘤的生长和繁殖，是目前国际上各国公认的生物抗癌领域中效率最高的真菌，因此桑黄成为国内外医药界研究的热点。桑黄的主要化学成分有很多，主要是：萜类、黄酮类和多糖等。许多研究表明多糖是桑黄最重要的生物活性成分，它在抑制肿瘤细胞方面作用尤其显著，它不但存在于桑黄子实体，也存在于桑黄的菌丝体中和桑黄的发酵液中[3-4]。随着产业的升级进步，超声波微波辅助提取技术被应用于真菌或植物活性物质的提取，特别是一些富有前瞻性的产业化工厂也将其应用于真菌多糖的提取，但得率仍然比较低，有一些研究也应用微波辅助技术，技术有着反应条件温和、周期短、成本低等优势，也有报道此技术运用到真菌多糖的提取中[5-6]，将超声波微波技术运用到桑黄多糖提取的研究却是非常少的。本次研究中应用超声波协同微波法对桑黄进行多糖的提取，寻找最佳提取条件，最大限度的提高桑黄多糖得率，并且为桑黄产业化提供可行的理论基础。本研究应用复合超声波微波法对桑黄子实体多糖进行提取，然后对提取得到的多糖进行活性研究，其研究结果能为桑黄开发和综合利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

桑黄子实体：浙江省淳安千岛湖桑都食用菌合作社；超纯水：南京林业大学食品实验室自制；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxido，DMSO）：Sigma 公司；乙醇（纯度 95%）：南京化学试剂公司；96 孔细胞培养板：Costar 公司；RPMI 1640 培养基、DMEM培养基、胎牛血清：Gibco 公司；EnoGeneCellTMCounting Kit-8（CCK-8）细胞活力检测试剂盒：南京恩晶生物科技有限公司；紫杉醇：中国四川太极制药公司。

1.2 仪器与设备

XO-SM200 超声波微波辅助提取设备：中国南京先欧仪器制造有限公司；QT-58A 紫外检测仪：中国上海琪特仪器公司；TU-1800PC 紫外可见分光光度计：中国北京普析通用公司；SW-CJ-1FD 超净工作台：苏州安泰空气技术公司；MCO-15AC 二氧化碳培养箱：日本三洋SANYO；XD-202 荧光倒置生物显微镜：中国南京江南永新公司；Thermo MK3 酶标仪：美国热电有限责任公司。

1.3 试验方法

1.3.1 桑黄多糖提取工艺流程

桑黄子实体→粉碎→超声波微波复合提取→过滤→80%醇沉→离心→沉淀复溶→醇沉→干燥→粗多糖

1.3.2 桑黄多糖提取工艺单因素试验

1）提取时间的选择：称取5 份2.0 g 的桑黄菌干粉，每份样品分别注入100 mL 的蒸馏水，液料比为50 mL/g，设定超声波功率为360 kW，微波功率为100 W，提取温度为100 ℃，在此条件下，提取时间设定为 20、30、40、50、60 min，然后测定样品的多糖含量，并计算多糖的提取率。

2）提取液料比的选择：精确的称取5 份2.0 g 的桑黄菌干粉，设定超声波的功率为360 kW，提取时间设定为40 min，提取温度为100 ℃，5 份样品的液料比分别以 20、30、40、50、60 mL/g，提取结束后，分别测定提取物的多糖的含量和多糖的提取率。

3）超声波功率对桑黄多糖提取率的影响：分别称取2.0 g 桑黄菌粉5 份，液料比为50 mL/g，按比例加入蒸馏水，超声波功率设定为 60、180、360、720、900 kW，微波功率为100 W，提取温度为100 ℃，处理时间设定为40 min，分别测定多糖的含量和多糖提取率。

4）微波功率对桑黄多糖提取率的影响：试验中称取5 份桑黄菌粉2.0 g，加入蒸馏水，溶液的液料比为50mL/g。设定超声波功率为360kW，提取温度为100℃，分别在微波功率 100、200、300、400、500 W 条件下，处理40 min，提取结束后测定样品中多糖的含量和多糖的提取率。

1.3.3 桑黄多糖提取工艺正交试验设计

试验首先进行单因素试验，然后在此基础上，进一步采用三因素三水平的提取试验见表1，按L9（34）的正交设计方案，设计并且实施多糖提取的正交试验，每组试验都要重复3 次以上。

表1 正交试验因素水平表Table Factors and levels used in orthogonal array design

1.3.4 总糖含量与蛋白质含量测定

本次试验采用的是苯酚－硫酸法，选择以葡萄糖为试验的标准品，通过试验测定样本总糖含量；本试验中，选择以牛血清白蛋白为标准品，采用考马斯亮蓝法，测定样品中蛋白质的总含量。

1.4 试验条件

1.4.1 桑黄多糖体外抗氧化活性

1）清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH）能力测定：称取样品分别配制成 12.5、25、50、100、200、400、800 μg/mL 浓度的溶液。配制 0.1 mmol/L DPPH 溶液。准确移取各个待测液2.0 mL 于10 mL 透明试管中。使用移液管分别加入2.0 mL，0.1 mmol/LDPPH 溶液，用振荡机混匀，放置一段时间，再用紫外分光光度计测定517 nm 波长处的吸光度，记为A样品。做3 组平行试验。准确移取各浓度待测液2.0 mL 与相应溶剂（水）2.0 mL，再用振荡机混匀，放置一段时间，测定在517 nm 波长处的吸光度，记为A对照。准确移取DPPH溶液2.0 mL 与相应溶剂（无水乙醇）2.0 mL，振荡机混匀，测定在517 nm 波长处的吸光度，记为A空白。为了分析试验结果，VC作为阳性对照物，按以下公式计算DPPH 自由基清除率：

式中：I 为样品对超氧负离子的清除率，%；A样品为样品测试值；A空白为空白值；A对照为对照值。

2）清除超氧负离子的测定：样品被盐酸三羟甲基氨基甲烷（Tris（hydroxymethyl）aminomethane，Tris-HCl）缓冲液（pH 值为 8.0，浓度为 16 mmol/L）溶解，制成不同浓度的溶液。氯化硝基四氮唑蓝（nitrotetrazole chloride blue，NBT）、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nionamide adenine dinucleotide，NADH） 均 用 Tris-HCl 缓 冲 液（pH8.0，16 mmol/L）溶解，浓度分别为 300、468 μmol/L；然后用蒸馏水溶解吩嗪硫酸甲酯（phenazine methyl sulfate，PMS），其浓度为 60 μmol/L。取 1.50 mL 不同浓度的样品溶液，0.50 mL NBT，0.5 mL NADH，混匀，加入0.5 mL 的PMS，然后将桑黄样品更换为1.50 mL 的缓冲溶液，作为试验中的空白对照。然后按照相同的操作方法，在25 ℃的水浴中放置5min 后，测定样品的吸光度（波长为560 nm），每次操作重复3 次以上。试验结束后，计算超氧负离子清除率I，计算公式为：

式中：I 为试验样品对超氧负离子的清除率，%；A样品为样品的测试值；A空白为空白对照值。

1.4.2 桑黄多糖体外抗肿瘤活性

CCK-8 染色法检测细胞活力：试验中挑选活细胞比例90%以上的细胞，进行样品测试。细胞增殖抑制试验采用EnoGeneCelTMCounting Kit-8（CCK-8）细胞活力检测试剂盒。制成浓度为1×105个/mL 的细胞悬液，试验中，在96 孔板中，每一个孔中加入100 μL 细胞悬液；然后将96 孔板放置于37 ℃，5%CO2培养箱中培养，培养时间为24 h；每一个孔，分别加入100 μL相应的含药物的培养基。试验中，要求同时设立阴性对照组，阳性对照组和溶媒对照组，每一个组要求5 复孔；96 孔板放置于培养箱中培养，温度为37 ℃，CO2浓度为 5%，培养 72 h；每孔加入 10 μL CCK-8 溶液，试验中将培养板放置在培养箱内孵育，时间设定为4 h，用酶标仪测定在450 nm 处的OD 值，计算桑黄多糖对人肝癌细胞HepG2，人宫颈癌细胞Hela 细胞的抑制率及IC50值。

1.5 数据分析

利用SPSS 12.0 软件进行数据分析（t 检验），分析组间差异。试验数据用表示。

2 结果与分析

2.1 超声波微波协同作用

液料比对桑黄子实体多糖得率的影响见图1。

图1 液料比对桑黄子实体多糖得率的影响Fig.1 Effect of liquid-to-material ratio on the extraction yield of polysaccharides

由图1 可知，桑黄多糖热水提取过程中，随着液料比增大，桑黄多糖得率显著增高，较高的液料比加快了水的传质过程，当液料比为50 mL/g 时，桑黄多糖得率最高，但高于50 mL/g 时，得率又会下降，因此，选择液料50 mL/g 比较合适。

超声功率对桑黄子实体多糖得率的影响见图2。

如图2 所示，随着超声波功率的加大，桑黄多糖得率大幅的增加，功率在360 kW 时多糖的得率达到最高值，之后多糖得率迅速下降，大功率超声波对细胞壁和细胞膜的破坏作用较大，使桑黄多糖结构发生破坏或者使其降解。

微波功率对桑黄子实体多糖得率的影响见图3。

如图3 所示，微波功率在200 W 时，多糖的提取率最高，超过200 W，提取率开始下降。

图2 超声功率对桑黄子实体多糖得率的影响Fig.2 Effect of ultrasonic power onthe extraction yield of polysaccharides

图3 微波功率对桑黄子实体多糖得率的影响Fig.3 Effect ofmicrowave power on the extraction yield of polysaccharides

提取时间对桑黄子实体多糖得率的影响见图4。

图4 提取时间对桑黄子实体多糖得率的影响Fig.4 Effect of ultrasound treatment time on the extraction yield of polysaccharides

桑黄子实体提取过程中，由图4 可知，多糖得率随着提取时间增加而增大，30 min 内的增加趋势明显，30 min 时达到最大值，30 min 之后多糖得率反而缓慢下降。当超声波与微波作用于桑黄时间太长，会使桑黄中的多糖成分受到一定的破坏，而使得率降低。提取时间对桑黄子实体多糖得率的影响，试验结果显示随着温度的逐渐升高，总糖得率逐渐增加。温度越高提取效果越好，最佳提取温度选为100 ℃。

按照液料比50 mL/g，提取温度为100 ℃，以超声波功率、微波功率、提取时间等作为影响多糖提取率的因素，试验在单因素试验的基础上设计L9（34）正交试验，进一步研究超声波微波协同辅助提取桑黄子实体多糖的最优提取工艺参数，正交试验设计与结果见表2，正交试验方差分析表见表3。

表2 正交试验设计与结果Table 2 Results and range analysis of orthogonal array design

表3 正交试验方差分析表Table 3 Analysis of variance in orthogonal array design

如表2 和表3 所示，显示试验显著性最强的单因素为超声波功率，其次是提取时间，最后为微波功率。由试验结果可得超声波微波辅助提取法的最佳工艺为超声功率360 W、微波功率100 W、提取时间30 min、液料比50 mL/g 时，多糖得率最高，达10.6%。

在提取过程当中超声波能够在提取溶液中产生空穴现象，这种空穴现象可以加速桑黄细胞内多糖成分的快速溶出，另外也要考虑超声波的次级效应，比如我们非常熟悉的机械振动和化学效应等，这些效应也可以加速桑黄细胞壁多糖的扩散释放，多糖从真菌组织释放后超声波使其充分与溶剂混合。微波可快速穿透桑黄，也可以被桑黄吸收产生热。所谓的超声波微波协同技术就是将超声振动与微波两种不同的作用方式结合在一起，有效的利用微波的高能作用与超声波振动的空穴作用，对桑黄进行快速、高效、可靠的提取。与其他提取方法相比，比如热水提取法，超声波微波辅助提取法，是基于超声波和微波场的瞬时穿透性加热方式，它是一种更有效更快速的提取法，现在它被广泛应用植物活性物质的提取，被提取组分在微波场作用下迅速产生大量热能，可加速植物组织内被提取组分由固体内部向固液界面扩散的速率。超声波微波提取显著的优于传统热水提取法，此项技术有效提高了提取的选择性，减少了提取时间。传统热水提取法和超声波微波提取法提取多糖后组织的显微结构，证实超声波和微波的协同效应对真菌细胞具有膨爆作用。超声波微波协同条件下真菌多糖的提取是一快速的组织崩解过程，这一过程使提取时间缩短，而且多糖得率也能有效提高，多糖的生物活性也能一定程度的提高[7-8]。

2.2 桑黄多糖活性研究

对热水法和超声波微波辅助提取的多糖进行含量测定，热水法和超声波微波辅助提取的多糖含量分别为20.1%和21.4%。对热水法和超声波微波辅助提取的多糖进行清除DPPH 和清除超氧负离子的活性测定。桑黄多糖对DPPH 的清除率曲线见图5。

图5 桑黄多糖对DPPH 自由基的清除率曲线Fig.5 Scavenging curves of the polysaccharides from Phellinus igniarius DPPH free radicals

如图5 所示，随着桑黄多糖浓度的逐渐增加，其清除DPPH 自由基的能力增强，而且清除效果与桑黄质量浓度之间存在明显的量效关系。

桑黄多糖对超氧阴离子清除率曲线见图6。

如图6 所示，桑黄多糖清除超氧负离子的能力虽然不及VC，但也呈现很强的抗氧化性。超声波微波辅助提取桑黄多糖其抗氧化活性显著高于热水法提取的多糖。

图6 桑黄多糖对超氧阴离子清除率曲线Fig.6 Scavenging curves of the polysaccharides from Phellinus igniarius superoxide anion radicals

桑黄多糖质量浓度对Hela 癌细胞的抑制率见图7。

图7 多糖质量浓度对Hela 癌细胞的抑制率Fig.7 Effects of different polysaccharide concentrations on inhibitive rate of cancel cell Hela

如图7 所示，对热水法和超声波微波辅助提取的多糖进行抗肿瘤对比试验可知，桑黄多糖对对人宫颈癌细胞Hela 有较强的细胞毒活性。热水法提取的桑黄多糖其 IC50值为 0.95 mg/mL，在浓度 1.5 mg/mL 时Hela 的抑制率为60.74%；超声波微波法提取的桑黄多糖其IC50值为0.81 mg/mL，在浓度1.5 mg/mL 时Hela的抑制率为65.20 %，超声波微波提取桑黄多糖其抗肿瘤活性更强。阳性对照药紫杉醇注射液在浓度0.01 mg/mL 时Hela 的抑制率为73.73%。对比紫杉醇注射液，桑黄多糖抗肿瘤活性虽未超过，但也表现出很强的抗肿瘤活性[8-10]。

桑黄多糖质量浓度对HepG2 癌细胞的抑制率见图8。

从图8 可知，桑黄多糖对人肝癌细胞HepG2 亦具有一定的细胞毒活性，热水法提取的桑黄多糖其IC50值为0.79 mg/mL，在浓度1.5 mg/mL 时抑制率为66.01%；超声波微波法辅助提取的桑黄多糖其IC50值为0.60 mg/mL，在浓度1.5 mg/mL 时抑制率为68.20%，超声波微波提取桑黄多糖其抗肿瘤活性更强。阳性对照药紫杉醇注射液在浓度0.01 mg/mL 时HepG2 的抑制率为73.07%。对比紫杉醇注射液，桑黄多糖抗肿瘤活性虽未超过，但也表现出很强的抗肿瘤活性[8-10]。试验结果表明，超声波微波辅助提取不但效率高，而且可以提高多糖的活性。

图8 多糖质量浓度对HepG2 癌细胞的抑制率Fig.8 Effects of different polysaccharide concentrations on inhibitive rate of cancel cell HepG2

3 结论

相比传统热水提取法，应用超声波微波复合法辅助提取桑黄多糖，有效提高了提取率[11-12]，多糖得率最高达到10.6%。正交试验结果表明不同提取因素对桑黄子实体多糖得率的影响顺序为：超声功率＞提取时间＞微波功率。热水提取法与超声波微波辅助提取法，这两种方法提取的桑黄多糖，进行了抗氧化及抗肿瘤活性研究，发现通过超声波微波辅助提取的桑黄多糖有较好的抗氧化和抗肿瘤活性[11-12]。