女贞子提取物中齐墩果酸含量及抗肿瘤活性研究

王沛君，王森业，徐瑞芳，冯瑞，张磊，李晓楠，孙颜杰，2，*

（1.新乡医学院三全学院，河南新乡453000；2.新乡医学院，河南新乡453000）

女贞子为木犀科植物女贞（Ligustrum lucidum Ait）的干燥成熟果实，在浙江、江苏、河南等均有产，味甘、苦，性凉，归肝、肾经，常用于肝肾阴虚，眩晕耳鸣，腰膝酸软，须发早白，目暗不明，内热消渴，骨蒸潮热等[1]。有研究表明，齐墩果酸是女贞子中的重要活性成分之一，具有护肝肾[2]、抗病毒[3]、调血脂[4]、抗菌[5]、降血糖[6]、抗肿瘤[7]等多种药理作用。近年来对女贞子中齐墩果酸的提取工艺甚多，常见的有回流提取法、超声波辅助提取法、冷浸法等。如蒋珍菊[8]、莫颖华[9]、郗艳丽[10]对女贞子中齐墩果酸的提取进行了一定的探索和优化，但是较少文献比较不同提取方法提取的效果。因此本试验采用乙醇回流法、超声辅助提取法、索氏提取法、冷浸法4 种方法对女贞子中的齐墩果酸进行提取，确定最佳工艺；文献报道女贞子主要成分齐墩果酸具有抑制人乳腺癌、肺癌细胞（MCF27）增殖和诱导凋亡的作用[11]，董静[12]报道齐墩果酸对S180 荷瘤小鼠肿瘤细胞的凋亡有明显的影响，细胞凋亡发生率明显增加，也指出女贞子中天然有效成分齐墩果酸可下调肿瘤细胞中的B 淋巴细胞瘤-2 基因（Bcl-2）蛋白的表达，使肿瘤细胞中细胞色素C 与Caspase-3 的表达水平增高，从而达到抑制荷瘤小鼠肿瘤的增长的作用。本试验在已有研究的基础上以人结肠癌细胞和肝癌细胞为研究对象，对女贞子提取物体外抗肿瘤活性做进一步研究，观察细胞的形态变化，探讨诱导细胞凋亡的影响，推动提取物的临床应用，为开发女贞子提供科学的参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 试验材料

女贞子于2017年11月采自河南省新乡市新乡医学院三全学院，将材料于50 ℃烘箱中干燥，保存于新乡医学院三全学院药学院，备用。

1.1.2 仪器

N4 紫外可见分光光度计：上海仪电分析仪器有限公司制造；BT125D 电子分析天平：赛多利斯科学仪器北京有限公司；HH-2 数显恒温水浴锅：金坛市华峰仪器有限公司制造；101 型电热鼓风干燥箱：上海科恒实业发展有限公司；CL-2 型恒温加热磁力搅拌器：巩义市予华仪器有限责任公司；SENCO 旋转蒸发仪：上海申生科技有限公司；SHB-3 循环多用真空泵：郑州杜甫仪器厂；CX22 倒置显微镜：奥林巴斯公司；CO2培养箱：英国Biotech 公司；ELISA 分光光度计：上海光谱仪器有限公司；KQ-500E 型超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司。

1.1.3 试剂

齐墩果酸标准品（C1723001）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司、噻唑蓝（MTT）：Sigma 试剂公司；二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、95%乙醇、无水甲醇、乙酸乙酯、冰乙酸、香草醛、高氯酸：天津市德恩化学试剂有限公司，均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 供试品溶液的制备

1.2.1.1 超声辅助提取法

称定女贞子5.0 g，置于具塞锥形瓶中，加入10 倍量的95%乙醇，超声辅助提取30 min，过滤，重复3 次，合并3 次滤液，减压浓缩干燥得提取物，甲醇定容于100 mL 容量瓶中，摇匀，即得。

1.2.1.2 索氏提取法

称定女贞子5.0 g，置于索氏提取器中，加入10 倍量的95%乙醇，在85 ℃下回流3 次，每次2 h，合并3次滤液，减压浓缩干燥得提取物，甲醇定容于100 mL 容量瓶中，摇匀，即得。

1.2.1.3 回流提取法

称取女贞子5.0 g，置于250 mL 圆底烧瓶中加10倍量的95%乙醇回流提取，每次2 h，重复3 次，合并3 次滤液，减压浓缩干燥得女贞子提取物，甲醇定容于100 mL 容量瓶中，摇匀，即得。

1.2.1.4 冷浸法

称定女贞子5.0 g，参考秦晶晶等[13]文献制备，减压浓缩干燥得提取物，甲醇定容于100 mL 容量瓶中，摇匀，即得。

1.2.2 齐墩果酸标准曲线的绘制

参照李西腾等[14]文献，精密称取齐墩果酸标准品5.0 mg，加甲醇定容于50 mL 容量瓶中，摇匀即得浓度为0.10 mg/mL 的对照品溶液。精密吸取齐墩果酸标准品溶液 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 置于试管中，80 ℃水浴蒸干甲醇，加0.2 mL 香草醛-冰乙酸溶液和0.8 mL高氯酸，在60 ℃水浴加热15 min 后，移入冰水浴中，再加入4.0 mL 的乙酸乙酯，摇匀，在560 nm 处测定吸光度值。以齐墩果酸浓度（μg/mL）为横坐标，吸光度值为纵坐标进行线性回归，得线性回归方程，计算R2。

1.2.3 精密度试验

分别精密吸取6 份对照品溶液0.3 mL，按1.2.2 项下方法测定吸光度值，计算平均值及RSD（%）值。

1.2.4 稳定性试验

精密吸取1.2.1.3 项下供试品溶液1.0 mL，甲醇定容于10 mL 容量瓶中，得供试品稀释液。分别精密吸取 6 份上述稀释液 0.5 mL，于 0、2、4、6、8、10 h 按 1.2.2方法测定吸光度值，计算平均值及RSD（%）值。

1.2.5 重复性试验

精密吸取1.2.1.3 项下供试品溶液1.0 mL，甲醇定容于10 mL 容量瓶中，得供试品稀释液，分别精密吸取6 份上述稀释液0.5 mL，按1.2.2 方法测定吸光度值，计算平均值及RSD（%）值。

1.2.6 加样回收率试验

精密吸取1.2.1.3 项下供试品溶液1.0 mL，甲醇定容于10 mL 容量瓶中，得供试品稀释液，分别精密吸取6 份上述稀释液0.2 mL，再加入对照品溶液0.2 mL，按1.2.2 项下方法操作，测定吸光度值，计算平均值及RSD（%）值。

1.2.7 样品的含量测定

分别精密吸取1.2.1 项下供试品溶液1.0 mL，甲醇定容于10 mL 容量瓶中，得供试品稀释液，分别精密吸取3 份上述稀释液0.5 mL，按1.2.2 项下方法测定吸光度值，运用回归方程计算样品含量。

1.3 女贞子提取物对肿瘤细胞增殖影响

1.3.1 MTT 的配制

MTT 在无菌条件下，用高压过的磷酸缓冲盐溶液（phosphste buffer saline，PBS）配成 2 mg/mL，0.22 μm 无机滤膜过滤除菌，4 ℃冰箱避光保存。

1.3.2 药物稀释

称取药物，使用90 % DMSO 作为溶剂，配成14.000 mg/mL，并用 0.22 μm 有机滤膜过滤除菌，4 ℃保存。使用时按等比例稀释依次用90%DMSO 配成相应的浓度，使用后，药物保存于4 ℃。

1.3.3 细胞处理

将细胞培养在含10%新鲜灭活胎牛血清的RPMI-1640 培养基中，于恒温培养箱（37 ℃，5%CO2）。结合李康等[15]文献，待HCT116 与HepG2 细胞生长良好并处于对数生长期时用0.25%的胰酶消化，收集并计数，均匀的铺到 96 孔板中（约 7×103个/孔），在二氧化碳恒温培养箱中培养24 h，当细胞完全贴壁并且呈对数生长期时，加入各浓度梯度的药物，同时设置阳性对照组（90%DMSO），每个药物浓度设置3 个复孔。在相同条件的培养箱中继续培养24 h，于倒置显微镜下观察细胞形态变化。在二氧化碳恒温培养箱中孵育48 h 后，每孔加入 10 μLMTT（2 mg/mL），在二氧化碳恒温培养箱中继续孵育4 h 后，终止培养，吸去培养孔中的液体。每孔加入100 μL DMSO 溶液，并设置空白对照组。置于低速摇床上振荡10 min，以溶解残留的MTT-甲臜结晶，于多功能酶标仪上495 nm 处测定各孔的吸光度。以吸收抑制百分比为生长抑制率，试验重复3 次，按照公式：生长抑制率/%=1-[（试验组OD值-空白孔OD 值）/（阳性对照组OD 值-空白对照组OD 值）]×100，计算女贞子提取物对两种癌细胞增殖的抑制效果，齐墩果酸标准品步骤同上，并计算半数抑制浓度。

1.3.4 数据统计分析

试验数据绘图采用Microsoft Excel 2010 进行，数值表示为平均值D，半数抑制浓度采用SPSS.22 进行计算。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的制备

以齐墩果酸浓度x（μg/mL）为横坐标，吸光度值（A）为纵坐标，通过线性拟合得回归方程为y=0.008 8x-0.065 5，相关系数R2=0.999 5 大于0.99，标准曲线见图1。表明齐墩果酸浓度在 20 μg/mL～120 μg/mL 范围内与吸光度具有良好的线性关系。

图1 齐墩果酸的标准曲线Fig.1 Standard curve of oleanolic acid

2.2 精密度试验结果

精密度试验结果见表1。

由表1 可知，测得6 份齐墩果酸标准品溶液的平均吸光度值为0.171，相对标准偏差值（relative standeard deviation，RSD）为0.52%，表明本试验的精密度良好。

表1 精密度试验结果（n=6）Table 1 The results of precision experiment（n=6）

2.3 稳定性试验结果

稳定性试验结果见表2。

表2 稳定性试验结果（n=6）Table 2 The result of stability experiment（n=6）

由表2 可知，测得 0、2、4、6、8、10 h 供试品溶液的平均吸光度值为0.512，相对标准偏差值RSD 为0.17%，表明本试验的稳定性良好。

2.4 重复性试验结果

重复性试验结果见表3。

由表3 可知，测得6 份供试品溶液的平均吸光度值为0.171，相对标准偏差值RSD 为0.52%，表明本试验的重复性良好。

表3 重复性试验结果（n=6）Table 3 The results of repeatability experiment（n=6）

2.5 加样回收试验结果

加样回收试验结果见表4。

表4 加样回收试验结果（n=6）Table 4 The results of sample addition experiment（n=6）

由表4 可知，测得6 份供试品溶液的平均加样回收率为100.2%，相对标准偏差RSD 为0.76%，表明本试验的加样回收率良好。

2.6 不同提取方法中的齐墩果酸含量的结果

按照“1.2.2”项下方法对“1.2.1”项下供试品溶液进行齐墩果酸含量测定，结果见表5。

表5 不同提取方法中的齐墩果酸含量Table 5 Contents of oleanolic acid in different extraction methods

由表5 可知，4 种不同提取方法中的齐墩果酸含量由高到低依次为回流提取法（13.13±0.03）mg/g、索式提取法（12.19±0.03）mg/g、超声辅助提取法（11.56±0.02）mg/g、冷浸法（11.16±0.02）mg/g。

2.7 女贞子提取物对人结肠癌、人肝癌细胞增殖的影响

2.7.1 女贞子提取物及齐墩果酸标准品干预HCT116细胞48 h 后的细胞形态

女贞子提取物及齐墩果酸标准品干预HCT116 细胞48 h 后的细胞形态见图2。

图2 各组干预HCT116 细胞48 h 后的细胞形态（×200）Fig.2 Cell morphology of HCT116 cells after 48 h intervention in each group（×200）

如图2 所示，女贞子提取物与齐墩果酸标准品作用于HCT116 细胞48 h 后，细胞形态皱缩，有变圆趋势，且部分细胞有漂浮现象。随着其浓度的增大，细胞形态受损程度也逐渐增强。由F 与J 两个图片对比可知，同浓度下的女贞子提取物与齐墩果酸标准品作用于HCT116 细胞，女贞子提取物使细胞皱缩与受损的程度强于齐墩果酸标准品。

2.7.2 女贞子提取物及齐墩果酸标准品干预HEPG2细胞48 h 后的细胞形态

女贞子提取物及齐墩果酸标准品干预HEPG2 细胞48 h 后的细胞形态见图3。

图3 各组干预HEPG2 细胞48 h 后的细胞形态（×200）Fig.3 Cell morphology of HEPG2 cells after 48 h intervention in each group（×200）

如图3 所示，女贞子提取物与齐墩果酸标准品作用于HEPG2 细胞48 h 后，细胞形态皱缩，有变圆趋势，且部分细胞有漂浮现象。随着其浓度的增大，细胞形态受损程度也逐渐增强。由P 与R 两个图片对比可知，同浓度下的女贞子提取物与齐墩果酸标准品作用于HEPG2 细胞，女贞子提取物使细胞皱缩与受损的程度强于齐墩果酸标准品。

2.7.3 女贞子提取物及其齐墩果酸标准品对人结肠癌细胞增值的影响

女贞子提取物及其齐墩果酸标准品对人结肠癌细胞增值的影响见图4。

如图4 所示，不同浓度的女贞子提取物与齐墩果酸标准品作用于人结肠癌细胞48 h 后，经过MTT 法检测发现，当女贞子提取物浓度为0.05 μg/mL 时对人结肠癌细胞的抑制率为0.57%，齐墩果酸标准品浓度为0.05 μg/mL 时对人结肠癌细胞的抑制率为0.10%，当两者的浓度增加到35.00 μg/mL 时，对人结肠癌细胞的抑制率分别为88.58%、86.93%，由此可见女贞子提取物与齐墩果酸标准品对人结肠癌细胞的抑制作用呈现出一定的浓度相关性，且女贞子提取物对人结肠癌细胞的抑制作用强于齐墩果酸标准品。

图4 女贞子提取物及其齐墩果酸标准品对人结肠癌细胞增值的影响Fig.4 Effect of Fructus Ligustri Lucidi and the standard oleanolic acid on the proliferation of human colon cancer cells

2.7.4 女贞子提取物及其齐墩果酸标准品对人肝癌细胞增值的影响

女贞子提取物及其齐墩果酸标准品对人肝癌细胞增值的影响见图5。

图5 女贞子提取物及齐墩果酸标准品对人肝癌细胞增值的影响Fig.5 Extract of Fructus Ligustri Lucidi and the standard oleanolic acid on the proliferation of liver cancer cells

如图5 所示，不同浓度的女贞子提取物与齐墩果酸标准品作用于人肝癌细胞48 h 后，经过MTT 法检测发现，当女贞子提取物浓度为0.05 μg/mL 时对人肝癌细胞的抑制率为7.31%，齐墩果酸标准品浓度为0.05 μg/mL 时对人结肠癌细胞的抑制率为4.96%，当两者的浓度增加到35.00 μg/mL 时，对人肝癌细胞的抑制率分别为84.47%、78.00%，由此可见女贞子提取物与齐墩果酸标准品对人肝癌细胞的抑制作用也呈现出一定的浓度相关性，且女贞子提取物对人肝癌细胞的抑制作用强于齐墩果酸标准品。

由以上数据计算得女贞子提取物对人结肠癌细胞和人肝癌细胞 48 h 后的 IC50值分别为 22.08、13.47 μg/mL，齐墩果酸标准品对人结肠癌细胞和人肝癌细胞 48 h 后的 IC50值分别为 41.45、45.90 μg/mL。

3 结论

通过试验比较得出齐墩果酸的含量由高到低依次为回流提取法、索氏提取法、超声辅助提取法、冷浸法，与秦晶晶等[16]结果一致。超声辅助提取法，耗时短，易控制反应条件，但提取含量较低；冷浸法，操作简单，但耗时长，耗材大，提取含量最低；索氏提取法仅次于乙醇回流，但由于装置的特点，盛装药材有限，因此不作为首选工艺；乙醇回流法，操作简单，提取效率最高，因此首选乙醇回流提取法。

近年来，中药及其提取物在抗肿瘤的治疗研究中发挥着越来越重要的作用[17]，如高飞等[18]发现竹叶提取物具有潜在的抗肿瘤和神经保护的双重功效，谭辉等[19]发现紫山药花青素有一定的抗肿瘤效应。因此，改进和完善女贞子有效活性成分的提取工艺，深入研究其抗肿瘤成分及作用机制，对天然药物在抗肿瘤领域的应用有积极意义。

在体外抗肿瘤实验中，通过比较女贞子提取物和齐墩果酸标准品对两种癌细胞的IC50值，发现女贞子提取物对人结肠癌细胞的IC50值（22.08 μg/mL）小于齐墩果酸标准品对其的 IC50值（41.45 μg/mL），对人肝癌细胞的IC50值（13.47 μg/mL）小于齐墩果酸标准品对其的 IC50值（45.90 μg/mL），表明女贞子提取物对两种癌细胞的增殖均有显著的抑制作用，同时可以得出该提取物对人肝癌细胞的选择性优于结肠癌细胞，该差异考虑可能是关系到该提取物对两种肿瘤细胞的抑制机理不同，为以后抗肿瘤机制分析提供参考。这也是首次发现女贞子提取物对人结肠癌细胞HCT116有抑制作用，为充分开发利用女贞子提供了科学的参考依据。