UPLC-MS/MS法同时检测人血浆中拉莫三嗪和卡马西平浓度

陈 晓，朱 斌，杨 阳，安晓娟，胡翠玲

0 引言

拉莫三嗪(Lamotrigine，LTG)和卡马西平(Carbamazepine，CBZ)均为治疗癫痫的常用药物，二者单用或联合应用治疗复杂性癫痫发作。无论是实施临床治疗药物监测，以达到合理个体化用药，还是进行药代动力学研究，均需要准确快速的血药浓度检测方法。目前，文献报道的方法包括高效液相色谱法(HPLC)[1-4]，高效液相色谱质谱联用法(HPLC-MS/MS)[5-7]等，多为检测单一药物，且分析时间长，同时检测多种药物将会大大提高药物分析效率。而且文献报道的前处理方法-液液萃取法或固相萃取[2,3,6-9]比较费时费力。本研究旨在建立一种样品处理简便、快速、准确的超高液液相色谱-质谱联用(UPLC-MS/MS)法，同时测定拉莫三嗪和卡马西平的血药浓度，以满足临床研究的需要。

1 材料与方法

1.1 试剂与标准品 卡马西平标准品(美国Sigma公司，批号：C0450000，纯度≥98%)；拉莫三嗪标准品(美国Sigma公司，批号：T6062，纯度≥98%)；内标：西替利嗪(Cetirizine，CTZ)标准品(美国Sigma公司，批号：C0980650，纯度≥98%)；甲醇、乙腈、甲酸为色谱纯；试验用水为超纯水。

1.2 仪器 串联质谱仪4000 QTRAP (美国Applied Biosystems公司)；液相色谱仪ACQUITY UPLC H-Class System(美国沃特世公司)；涡旋混合器(XW-80A，上海医科大学仪器厂)；低速离心机(5417R 型，EPPENDORF，德国)；分析天平(TB-114，DENVER，USA)；Millipore Direct-Q3型纯水机等。

1.3 检测条件

1.3.1 液相条件 采用Waters ACQUITY BEH C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)色谱柱，流速：0.3 ml/min，柱温25 ℃，进样量10 μl，样品分析时间为3 min，流动相为甲醇(A)和0.1%甲酸(B梯度洗脱。流动相梯度洗脱程序：在 0～1.0 min 5% A，1.0～1.9 min线性增加至95%，在 1.9～ 2.4 min内A保持95%，在2.4～2.6 min内A线性降低至5%，然后A相保持5%至3 min，总分析时间为3 min。

1.3.2 质谱条件 采用电喷雾(ESI)离子源，选用多反应监测(MRM)在正离子电离模式下进行质谱扫描测定，拉莫三嗪、卡马西平和内标西替利嗪的离子对分别为m/z256.0→211.2、m/z237.0→194.1和m/z389.2→201.2。仪器参数设置如下，Cur：10 psi，CAD：medium，IS：5 000 eV，TEM：300 ℃，GS1：50 psi，GS2：20 psi，DP：120 V，EP：10 V；CXP：15 V，CE：37 V(LTG)、27 V(CBZ)、27 V(CTZ )。每个通道时间为200 ms。

1.4 溶液配制 精密称取拉莫三嗪标准品0.010 0 g，用 1.0 ml甲醇溶解，移入10.0 ml容量瓶中，定容至刻度，摇匀即得1 mg/ml标准储备液，置于冰箱-20 ℃保存。再用甲醇梯度稀释，配制各浓度100、200、500、1 000、2 000、5 000、10 000、20 000 ng/ml的标准工作液，置于冰箱-20 ℃保存。

卡马西平标准储备液的配制方法同上所述，得1.0 mg/ml。同样再用甲醇梯度稀释，配制各浓度 100、200、500、1 000、2 000、5 000、10 000、20 000 ng/ml的标准工作液，置于冰箱-20 ℃保存。然后将等体积的拉莫三嗪和卡马西平标准工作液混合，得50、100、250、500、1 000、2 500、5 000、10 000 ng/ml的混合标曲标准工作液，另外，配制QC标准工作液低、中、高浓度分别为100、2000、8 000 ng/ml，置于冰箱-20 ℃保存待用。

精密称取内标西替利嗪标准品 0.010 0 g，用1 ml甲醇溶解，移入10 ml容量瓶中，定容至刻度，摇匀即得1.0 ng/ml的标准储备液，用甲醇梯度稀释至1 000 ng/ml，置于冰箱-20 ℃保存待用。

1.5 样本处理 精密吸取血浆样品100 μl，置于1.5 ml的离心管中，加入内标西替利嗪溶液10 μl，旋涡10 s混匀后，加入500 μl甲醇，旋涡振荡1 min，15 000 r/min离心10 min，吸上清液150 μl于进样瓶，进样10 μl。

2 方法学确证

2.1 专属性 LTG、CBZ的准离子峰分别为m/z256.0和m/z237.0，二级质谱分析生成的主要碎片离子分别为m/z211.2和m/z194.1，内标CTZ的准离子峰和主要碎片离子峰分别为m/z389.2和m/z201.2。LTG、CBZ和CTZ标准品相应的二级全扫描质谱图见图 1。取空白血浆100 μl，按“1.5”项下方法操作，得到相应色谱图；另取空白血浆100 μl 3份，分别加入质量浓度均为50 ng/ml的LTG标准溶液、CBZ标准溶液及混合标准溶液各10 μl，按“1.5”项下操作，得到相应色谱图，见图2。

图1 质谱图

注：A.拉莫三嗪m/z256.0→211.2，B.卡马西平m/z237.0→194.1，C.西替利嗪m/z389.2→201.2

2.2 标准曲线和线性范围 精密吸取人空白血浆 90 μl，根据标准曲线浓度范围分别加入LTG和CBZ的混合标准工作液 10 μl，轻涡混匀制备成系列标准曲线样品，加入内标CTZ溶液10 μl，按上述“1.5”生物样品与处理方法处理后，进行UPLC分析，横坐标为已知浓度，纵坐标为分析所得不同浓度分析物峰面积与待测物峰面积之比，使用加权最小二乘法进行回归运算(权重系数为1/X2)，得LTG标准曲线回归方程：Y=0.001 1X-0.002 8 (R2=0.999 5)，CBZ标准曲线方程为：Y=0.002 2X-0.024 8 (R2=0.997 5)。结果表明，LTG和CBZ血药浓度均在 5～1 000 ng/ml范围内线性关系良好。LTG和CBZ的定量下限均为5 ng/ml(S/N>10)。

图2 色谱图

2.3 回收率和基质效应 制备人血浆中LTG和CBZ各质控浓度的样品(平行5个样本)，按上述“1.5”项生物样品与处理方法处理后，进行 UPLC-MS/MS分析，得目标分析物峰面积为A1，目标分析物峰面积经标准曲线换算得浓度 C；取空白人血浆样品数份，按“1.5”样品处理方法处理后，用所得溶液配制各质控浓度的分析物等标溶液(各平行 5 个样本)，进行UPLC-MS/MS 分析，得峰面积为A2；按“(A1/A2)×100%”计算提取回收率，LTG和CBZ提取回收率分别为81.3%～84.9 %和82.7～87.3 %。同时，制备目标分析物等浓度标液，进样分析，得其峰面积为A3，依“(A2/A3)×100%”来考察基质效应。通过相对标准偏差(RSD)反映基质效应的大小。基质效应RSD值应在±15%范围内。

2.4 精密度和准确度 制备LTG和CBZ各质控浓度生物样品(平行5个样本)，按上述“1.5”生物样品与处理方法处理后，进行UPLC-MS/MS 分析，考察方法的批内精密度和准确度；通过在连续不同天处理并检测3个合格的分析批样品。考察方法的批间精密度和准确度。精密度的RSD值在±15%范围内，准确度为85%～115%，见表1。

2.5 稳定性实验 见表2。取低(10 ng/ml )、中(200 ng/ml )、高(800 ng/ml )的血浆样品，分别于室温放置 0、12 h 后测定其回收率。每个条件下每个浓度点考察6份平行样本，结果表明，处理后的血浆样品室温放置 12 h内稳定(RSD<12.5%)。同法配制低、中、高质量浓度的标准品血浆样品各5份置于-20 ℃放置30 d，按“1.5”项下方法操作，测定其回收率，考察长期稳定性(RSD<13.4 %)。配制低、中、高质量浓度的标准品血浆样品各5份，置于-20 ℃，冷冻-解冷冻循环3次后，进样分析，考察反复冻融稳定性(RSD<14.8 %)。

表1 提取回收率、精密度和准确度结果(n=5)

表2 样本稳定性考察结果(n=5)

3 讨论

本研究采用甲醇蛋白沉淀的前处理方法，简便快速，同时使用ACQUITY BEH C18UPLC色谱柱，优化流动相后分析时间缩短至3 min，大大提高了分析效率。而且同时检测卡马西平和拉莫三嗪，标曲范围覆盖临床患者体内的药物浓度，非常适用于临床药代动力学研究和治疗药物监测。