UV-VIS法测定湿热消颗粒中总黄酮含量的不确定度评价

梁国成，陈舒茵，黄小鸥，冯文勇，方建康，覃 翔

0 引言

慢性前列腺炎(Chronic prostatitis，CP)是男科常见病及多发病，发病率高，临床以排尿异常、慢性盆腔疼痛为特征[1-4]。CP的临床发病机制较为复杂且尚未明确，因此，在CP的临床治疗中，难以准确对患者的病情做出根本改善。西医主要根据患者的临床病症进行针对性抗感染消炎治疗[5-7]，然而患者在临床对症缓解治疗的效果欠佳，并且常因多种因素在短期治愈后较为容易复发[8-9]。中药复方制剂对前列腺炎的疗效较好[10-13]，因此，研究开发有效的药物防治CP，尤其是疗效肯定、不良反应少、质量可控的中药、中成药尤为必要。

湿热消颗粒是由湿热消汤改剂型研制而成，湿热消汤是我院男性科名老中医长期用于防治CP的有效经验方，由金钱草、虎杖、板蓝根、黄芪等12味中药组成，前期的临床研究表明，湿热消方对防治CP具有良好的治疗效果[10-11]，而总黄酮为防治CP的有效成分之一[14-15]。

本试验采用紫外-可见分光光度法(UV-VIS)测定制剂中总黄酮的含量，UV-VIS法因其操作简单、适用性广等特点，已广泛应用于诸如总物质含量测定等药品分析领域。而试验样品在制备、测量过程中，常常会因为人为操作习惯、测量误差、结果读数误差或者测量用具自身误差等原因而不可避免地在测定过程和结果中引入一定误差，因此，试验所得的测量值只能得到真实值的近似值，存在一定的误差。不确定度的概念是合理的表征赋予被测量值的分散性与测量结果相关联的参数[16-17]，是目前研究者较为认可的一种科学、合理的质量控制方法和验证手段[18]，能够较为准确地评估测量结果。

本文建立了UV-VIS法测定湿热消颗粒中总黄酮含量的方法，并根据欧洲化学委员会颁布的Quantifying Uncertainty in Analytical Measurement要求[19]，对测定方法和结果进行不确定度评定，探讨该法试验过程中可能的不确定因素，提高试验数据和检测结果的准确性和可靠性。

1 仪器与试药

1.1 仪器 AE240分析天平(梅特勒-托利多公司)，DK-S26电热恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司)，53WBI微机型紫外-可见分光光度计(上海仪电分析仪器有限公司)，玻璃器皿为天玻牌A级。

1.2 试剂与试药 湿热消颗粒(自制，批号：1800508、1800511、1800517)，槲皮素对照品(中国食品药品检定研究院，批号：100081-201610，含量测定用)，乙醇(上海沃凯生物技术有限公司，分析纯)，无水乙醇(广东翁江化学试剂有限公司，分析纯)，AlCl3(天津市大茂化学试剂厂，分析纯)，NaCH3COOH(天津市大茂化学试剂厂，分析纯)，纯化水(自制)。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取槲皮素对照品10.13 mg，以70%乙醇定容于50 ml容量瓶中，再精密量取5 ml至10 ml容量瓶中，加70%乙醇至刻度线，摇匀，即得。

2.1.2 供试品溶液的制备 取本品15 g，精密加入70%乙醇100 ml，超声1 h[20]，过滤，定容于250 ml容量瓶中，精密移取续滤液10 ml至25 ml容量瓶中，加70%乙醇至刻度线，摇匀，即得。

2.2 检测波长选择 分别取对照品溶液、供试品溶液各2 ml，置于10 ml容量瓶中，20 ℃水浴加热，先加入1.2 ml的0.1 mol/L的AlCl3，后加入1.8 ml的1 mol/L的NaCH3COOH溶液，反应2 min后取出，用70%乙醇定容，摇匀，待溶液温度降至室温[21]，以相应试剂为空白，在200～500 nm范围进行紫外波长扫描，结果显示，槲皮素对照品溶液与供试品溶液于442 nm处有最大吸收，光谱图基本一致，最终选择检测波长为442 nm，结果见图1～图3。

2.3 线性及线性范围的考察 精密量取槲皮素对照品溶液1、2、3、4、5、6、7 ml分别置于10 ml容量瓶中，20 ℃水浴加热，先加入1.2 ml的AlCl3(0.1 mol/L)，后加入1.8 ml的NaCH3COOH溶液(1 mol/L)，反应2 min后取出，用70%乙醇定容，摇匀，待溶液温度降至室温，以相应试剂为空白，紫外-可见分光光度计在波长为442 nm处测量吸光度值。

以吸光度A(Y)为纵坐标，槲皮素含量(mg)(X)为横坐标绘制标准曲线。

2.4 方法学验证

2.4.1 精密度试验 精密吸取“2.1.2”项下供试品，在442 nm波长下，连续测定5次，其吸光度的RSD为0.12%，表明精密度良好。

2.4.2 稳定性试验 精密吸取“2.1.2”项下供试品，在442 nm波长下，分别于0、1、2、4、8、12 h测定，测定6次，其吸光度的RSD为0.23%，表明溶液在12 h内的稳定性良好。

2.4.3 重现性试验 取同一批次的湿热消颗粒5份，分别按“2.1.2”项下平行制备供试品溶液，依法进行测定，结果RSD为0.19%，表明样品重现性良好。

2.4.4 回收率试验 精密称取已知含量的供试品5份，分别精密加入槲皮素对照品，照“2.1.2”项下制备供试品溶液，依法测定总黄酮含量，计算加样回收率，结果见表1。

2.5 样品含量测定 取不同3个批次的湿热消颗粒，分别按“2.1.2”项下平行制备供试品溶液，并依法进行测定，结果见表2。

表1 槲皮素回收率试验结果(mg)

表2 样品含量测定结果(mg/mg)

3 不确定度的评定

3.1 不确定度的来源 试验过程中，不确定度主要来源于仪器和人工操作偏差。本试验过程中，不确定度的来源主要有：对照品溶液制备过程引入的不确定度、供试品溶液制备过程引入的不确定度、标准曲线拟合引入的不确定度、样品重复测定引入的不确定度以及回收率测定所引入的不确定度[22-25]。

3.2 量化不确定度分量

3.2.1 对照品溶液制备引入的不确定度 对照品制备过程中使用十万分之一天平精密称取10.13 mg，以70%乙醇定容于50 ml容量瓶(A级)中，再以5 ml单标移液管(A级)精密量取5 ml至10 ml容量瓶中，70%乙醇定容至刻度。故对照品溶液制备引入的不确定度U1有：①对照品称量的不确定度M1，电子天平经检定为1级，允许误差±0.100 mg；②溶液配制的不确定度V1，溶液配制过程用到50 ml、10 ml、5 ml单标移液管(A级)，据国家计量检定规程JJG196-2006要求[26]，允许误差分别为±0.050 ml、±0.020 ml、±0.025 ml。其分量评定结果见表3。

3.2.2 供试品溶液制备引入的不确定度 用十万分之一天平精密称取本品30 g，置于100 ml容量瓶(A级)中并精密加入70%乙醇100 ml，超声1 h，过滤，定容于250 ml容量瓶中，精密移取续滤液10 ml至25 ml容量瓶中，加70%乙醇至刻度线，摇匀。供试品溶液制备引入的不确定度U2有：①供试品称量的不确定度M2，电子天平经检定为1级，允许误差±0.100 mg；②溶液配制的不确定度V2，溶液配制过程用到100 ml、25 ml、10 ml允许误差分别为±0.010 ml、±0.030 ml、±0.020 ml。其分量评定结果见表4。

表3 对照品溶液的不确定度评定

表4 供试品溶液的不确定度评定

V2=0.003 5 ml,U2=0.003 5 mg

3.2.3 标准曲线拟合引入的不确定度 本试验配制了7个浓度含量的标准溶液Ci：0.010 13、0.020 26、0.030 39、0.040 52、0.050 65、0.060 72、0.070 84 mg，平均浓度C0=0.039 05 mg，在442 nm处测得平均吸光度Ai分别为：0.152、0.288、0.392、0.507、0.624、0.737、0.862，每个平行测定2次，用最小二乘法拟合，得到直线方程A=11.507X+0.042 8。见表5。

表5 线性最小二乘法拟合

取1份供试品，平行测定2次，由此得平均含量C0=0.031 7 mg。

3.2.4 样品重复测定的不确定度 取“2.4.1”同一份样品重复测定，5次测定得到含量分别为0.034 2、0.031 8、0.040 8、0.031 4、0.042 5 mg，平均含量为0.036 1 mg。

3.3 计算合成标准不确定度 各相对不确定度分量值及贡献率见表6。

3.4 扩展不确定度和报告不确定度 95%CI下，包含因子k=2，则相对扩展不确定度U95=k×U×100%=2×0.116 9×100%=23.38%。由试验测定湿热消颗粒中总黄酮含量W=0.031 9 mg/mg，故扩展不确定度为：U95(W)=0.031 9×0.233 8=0.007 5 mg/mg。故本次试验测定得到湿热消颗粒中总黄酮含量为：W=(0.031 9±0.007 5)mg/mg。

表6 UV-VIS测定湿热消颗粒中总黄酮不确定度分量评定表

4 讨论

总黄酮的含量测定方法有UV-VIS、HPLC、CE等[27-29]，其中以UV-VIS操作较为简单快速。黄酮及类黄酮化合物在200～800 nm光谱范围的扫描表明，部分黄酮类化合物吸收较弱或无最大吸收[30]，所以，采用UV-VIS法测定总黄酮含量常常显色后进行测定，其中应用最多的为金属离子络合法[31]。该法是黄酮类化合物在酸性或碱性条件下与金属离子发生络合反应后形成有色的鳌合物而产生较强的紫外吸收而测定含量，常用的显色方法有AlCl3、AlCl3-CHCOONa、NaNO2-Al(NO3)3-NaOH等。本试验采用AlCl3-CHCOONa法显色，效果良好。

UV-VIS以分子吸收光谱为基础，利用化合物分子在200～800 nm光谱范围具有紫外吸收的特点进行分析和测定，或经显色后产生紫外吸收而测定[31]，具有设备简单、适用性广、准确度和精密度高等优点，已在中药含量测定如总黄酮含量分析中广泛应用，且发挥着越来越重要的作用。在分析过程中，引入不确定度的概念，可最大程度地弥补因操作步骤繁多或操作不熟练、以及计量器具等因素而产生的误差，同时操作人员在试验过程中应尽可能减少操作步骤，提高操作熟练度，尽量避免使用小容量计量器具进行量取、定容等，以减少因主观和客观因素而引入的不确定度，提高测量结果的可靠性。

试验过程中，定量方法的相对扩展不确定度U95为23.38%，其中样品重复测定不确定度U4为33.92%，对样本含量测定结果影响较大。可能的原因有：①本次试验不确定度分量有由仪器测量的不确定度分量、样品重复测定的不确定度分量和加标准品回收率引入的不确定度分量，包含了重复性的不确定度，且后两者相关系数为-1，故应减除重复性；②根据“重复性测量误差与被测量的规格大小呈正比，而与被测量的级别高低呈反比”的普遍规律[32]，在进行样品的重复测定时，应尽可能采用较低规格(即浓度)的样品，或采用更高一级的标准样品(即纯度)，校准测量仪器，并给出仪器的量传误差[33]，从而得到比较满意的扩展不确定度，最终降低样品重复测定的不确定度U4。