黄芪甲苷对过氧化氢损伤模型人脐静脉内皮细胞的改善作用*

张 荔，孙付军，李贵海

（1.湖北省襄阳市中医医院，湖北 襄阳 441000； 2.山东省中医药研究院，山东 济南 250014）

大量研究表明，动脉粥样硬化、血栓、高血压及心力衰竭等心血管疾病均伴有血管内皮细胞损伤[1-2]。氧化应激是体内氧化与抗氧化作用失衡，一般是活性分子（如氧自由基）失调造成的，同时也是很多心脑血管疾病中内皮细胞损伤的重要原因[3-6]。黄芪甲苷是黄芪的有效成分之一，有抗凋亡、抗氧化、减轻脂质体过氧化、改善能量代谢等作用[7-9]。本研究中以黄芪甲苷作用于过氧化氢（H2O2）损伤的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）模型，观察各细胞因子水平，探讨黄芪甲苷在相应细胞粘附过程中的作用机制。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 细胞、试药与仪器

细胞：人脐静脉内皮细胞株（HUVECs，上海博古生物有限公司，批号为BG018）。

试药：黄芪甲苷粉剂（南京春秋生物有限公司，批号为 111920）；胎牛血清（批号为 42F9470K），维生素 E（批号为 00360），四氮唑盐（MTT，批号为 0793），均购自美国Sigma公司；RPMI-1640培养基（美国Gibco公司，批号为1908121）；超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒（批号为 20180809），乳酸脱氢酶（LDH）试 剂盒（批号为20180809），蛋白定量（BCA）试剂盒（批号为 PC200898），均购自南京建成生物工程研究所；胰蛋白酶（美国HyClone公司，批号为Q6949）；三氯甲烷（美国Amresco公司，批号为67-66-3）；逆转录试剂盒和实时荧光定量聚合酶链式反应试剂盒（美国Invitrogen公司，批号为00000541604）；细胞裂解液（上海碧云天生物技术有限公司，批号为P0013）。

仪器：SW-CJ-2FD型超净工作台（新加坡Esco公司）；IL-161CI型 CO2培养箱（日本 Sanyo公司）；A1301049型低温高速离心机（美国Beckman公司）；IX73型[1]倒置显微镜（日本Olympus公司）；PTC-200型实时荧光定量聚合酶链式反应仪（美国Bio-Rad公司）；xMark型酶标仪（美国BioTek公司）；EX1103型电子天平（上海上天精密仪器有限公司）；HZ211KB型汽浴恒温振荡器（江苏金坛市医疗器械厂）。

1.2 方法

细胞培养：用10%胎牛血清、RPMI-1640培养基于 CO2培养箱中培养HUVECs，待细胞长至 70%～80%融合状态时，用0.25%胰蛋白酶溶液消化，37℃条件下孵育2～3 min，显微镜下观察细胞收缩变圆时弃去胰酶终止消化，巴氏滴管吸取培养液，吹打瓶壁制成细胞悬液，将细胞悬液接种于新的细胞瓶中传代，继续培养，根据细胞数量每2～3 d传代1次。

分组、建模及给药：将对数生长期的HUVEC（密度为 5×104个 ／mL ），以每孔 200 μL 接种于 96孔板，培养24 h待细胞贴壁生长后，弃去培养基，每5孔为1组，分为正常对照组（A组，常规培养基），H2O2组（B组，300 μmol／L H2O2），阳性对照组（C 组，300 μmol／L H2O2+50 μg／mL 维生素 E），以及黄芪甲苷高、中、低剂量组（D1组、D2组、D3组，300 μmol／L H2O2+50.0，25.0，12.5 μg ／mL 黄芪甲苷）。

细胞活力测定：以MTT法测定。加药培养24 h后，弃去培养基，每孔加入 5 μg／mL MTT 溶液 10 μL，37 ℃孵育4 h，弃去上清液，加入100 μL二甲基亚砜，振荡10 min，在490 nm波长处，以酶标仪测定每孔的吸光度值（A），以空白对照（培养基）作为100%存活对照，计算细胞活力。细胞活力（% ）=（A用药组-A正常对照组）／（A正常对照组-A空白对照组）×100%。

LDH及SOD活性测定：加药培养细胞24 h后，弃去培养液，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗2次，加100 μL细胞裂解液，裂解完全后按试剂盒说明书方法测定LDH及SOD活性。

单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）及细胞间黏附分子1（ICAM-1）mRNA表达测定：加药培养细胞24 h后，弃去培养液，PBS洗2次，收集细胞，Trizol法提取RNA，鉴定完RNA纯度和完整性后，反转录制备cDNA；PCR反应条件为：95℃预变性2 min；94℃变性20 s，58℃退火30 s，72℃延伸20 s，循环40次[10]。实时荧光定量PCR反应结束后，定量分析PCR获得的熔解曲线和扩增曲线结果的可靠性，并设定循环阈值（Ct），以MCP-1／β-actin及ICAM-1／β-actin比值分别代表各自相对表达水平，2-ΔΔCt法计算 MCP-1 mRNA、ICAM-1 mRNA的相对表达量。各组设3个复孔，重复操作3次。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.3 统计学处理

采用SPSS20.0统计学软件分析。计量资料以表示，行单因素方差检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对模型细胞活力的影响

与A组比较，B组细胞活力显著减弱（P＜0.01）；与B组比较，C组及D1组，D2组，D3组细胞活力显著增强（P＜0.01）。详见表 2。

表2 黄芪甲苷对模型细胞活力的影响（n=5）

2.2 对模型细胞LDH及SOD活性的影响

与A组比较，B组细胞LDH活性显著增强，SOD活性显著减弱（P＜0.01）；与 B 组比较，C 组及 D1组，D2组，D3组细胞LDH活性显著减弱，SOD活性显著增强（P＜0.01）。详见表3。

表3 黄芪甲苷对模型细胞LDH和SOD活性的影响（U／mg，n=5）

2.3 对模型细胞MCP-1mRNA及ICAMmRNA的影响

与A组比较，B组细胞MCP-1 mRNA及ICAM-1 mRNA 表达显著增强（P＜0.01）；与 B组比较，C组及D1组、D2组、D3组细胞MCP-1mRNA及ICAM-1mRNA表达显著减弱（P＜0.01）。详见图1及图2。

图1 黄芪甲苷对模型细胞MCP-1 mRNA表达的影响（X ± s，n=5）

3 讨论

本研究中通过H2O2诱导HUVEC建立氧化损伤模型，探讨黄芪甲苷对HUVEC损伤的改善作用。H2O2能造成内皮细胞损伤及功能紊乱。黄芪甲苷可促进HUVEC血管内皮生长因子（VEGF）上调，通过刺激VEGF的表达而促进血管新生[11]。

MCP-1作为趋化因子家族蛋白，可趋化单核细胞向血管内皮的炎症部位聚集，加剧活化巨噬细胞粘附血管内皮，促进巨噬细胞进入血管壁形成泡沫细胞，加重血管炎症，从而导致动脉粥样硬化的形成[12-13]。ICAM-1在动脉硬化早期细胞的迁移和增殖、泡沫细胞的形成中具有重要作用，也是动脉粥样硬化病程中内皮细胞表达过程的重要黏附分子[14]。细胞受损时，细胞胞浆会释放LDH，因此将LDH的释放率作为细胞受损程度的敏感指标之一[15]。SOD是一种胞内氧化酶，可以清除氧自由基。本研究结果显示，黄芪甲苷能增强损伤模型细胞SOD活性，降低LDH活性，显示黄芪甲苷能增强细胞的抗氧化能力，抵抗氧化应激损伤，保护内皮细胞。黄芪甲苷能降低损伤模型MCP-1 mRNA和ICAM-1 mRNA表达，通过抑制单核细胞与内皮细胞的粘附和迁移，保护动脉粥样硬化中受损的内皮细胞。

综上所述，黄芪甲苷对H2O2损伤模型HUVEC有一定改善作用，其机制可能与减弱MCP-1 mRNA和ICAM-1 mRNA表达有关。