过表达Bestrophin 3对皮质类固醇诱导的股骨头坏死保护作用及其机制

董威 朱超华 王健 张海静 李军 赵振拴 李全海 张国平

河北医科大学第一医院1骨科，2细胞治疗中心（石家庄050031）

股骨头坏死（osteonecrosis of the femoral head，ONFH）是指股骨骨小梁、骨髓基质细胞的坏死，最终导致髋关节功能障碍，是一种顽固性、衰弱性的疾病，目前我国股骨头坏死每年新发病例15 ～20 万人，其常与骨疾病高病死率有关［1］。导致股骨头坏死的原因主要包括骨折愈合不良负重行走之后和骨组织自行病变，如有饮酒嗜好或患有需要长时间服用糖皮质激素的疾病，而有糖皮质激素服用史是导致股骨头坏死最常见的原因之一［2］。相关研究［3-4］表明，糖皮质激素服用使患者骨内基质细胞损伤程度严重，微循环障碍、血流不通畅等因素均会导致缺血性股骨头坏死。Bestrophins 3是阴离子通道成员［5］，通常用作氯化物参与调节细胞兴奋性或细胞通道的调节，目前已经鉴定出3 种同种型，即Bestrophin 1、Bestrophin 2 和Bestrophin 3［6］，有研究［7-8］表明糖皮质激素所引起的骨代谢异常与Bestrophin 3 表达有关。目前Bestrophin 3在股骨头坏死中的作用及机制鲜有报道，本文通过检测不同标本骨髓基质细胞Bestrophin 3 表达水平揭示Bestrophin 3 在内皮细胞损伤和皮质类固醇诱导股骨头坏死形成中的作用；且构建了不同Bestrophin 3 表达水平的细胞株，从细胞水平评估了Bestrophin 3 表达量与细胞生存率的相关性。本研究为评估Bestrophin 3 是否可作为治疗皮质类固醇诱导骨头坏死的新靶点提供实验依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料股骨头坏死患者纳入标准：单侧发病；观察组为皮质类固醇性股骨头坏死患者；无烟酒嗜好；都为新鲜股骨头坏死标本（骨折后7 d 内手术）。排除标准：非皮质类固醇性股骨头坏死患者；有饮酒史、吸烟史患者；有合并其他疾病的患者。根据以上标准选取2017年2月至2017年12月我院收治的创伤性骨折患者自愿捐赠的骨组织50 例为对照组，皮质类固醇性骨组织50例为观察组。观察组中男25 例，女25 例；对照组中男26 例，女24 例。两组受试者一般资料比较差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性，见表1。本研究经我院医学伦理委员会审核批准，所有受试者对本研究知情同意，并均签署知情同意书。

表1 观察组和对照组受试者一般资料比较Tab.1 Comparison of general data between observation group and control group ±s

表1 观察组和对照组受试者一般资料比较Tab.1 Comparison of general data between observation group and control group ±s

组别对照组观察组P 值例数50 50男/女26/24 25/25 0.589平均年龄（岁）43.91±3.54 43.27±2.97 0.236平均体质量（kg/m2）21.98±2.65 22.15±3.10 0.328平均病程（年）-3.98±1.21激素使用时间（月）-17.35±3.50

1.2 PCR 方法检测受试者股骨头中Bestrophin 3水平取两组受试者的股骨头骨组织标本，抽取股骨头颈部骨髓血4 ～6 mL，离心，纯化，分离获得骨髓基质细胞。依据异丙醇沉淀法步骤提取骨髓基质细胞中RNA，离心后加入25 μL 双蒸水溶解提取RNA。按照2×SYBR real-time RT-PCR premixture 试剂盒（北京百泰克生物技术有限公司）先用逆转录酶合成cDNA，再以cDNA 为模板进行实时荧光定量PCR 扩增反应。反应条件如下：95 ℃预变性50 s，1 个循环；95 ℃变性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35 个循环。实验引物由生工生物工程（上海）股份有限公司设计和合成。通过使用实时荧光定量PCR 仪（赛默飞世尔科技（中国）有限公司）测定PCR 数据，获得Ct 值，分析受试者Bestrophin 3 表达量利用相对定量的方法。

1.3 不同Bestrophin 3 表达水平细胞株的构建分离纯化获得的人股骨头骨微血管血管内皮细胞为细胞株C1。利用基因敲除的手段对人股骨头骨微血管血管内皮细胞的Bestrophin 3 进行基因敲除获得细胞株C2，Western Blot 检测Bestrophin 3 的表达水平；构建过表达Bestrophin 3 基因细胞株C3 的方法是把人股骨头骨微血管血管内皮细胞的Bestrophin 3 基因连接到含有强启动子的表达载体上，Western Blot 检测Bestrophin 3 的表达水平。

1.4 Western Blot 检测细胞株Bestrophin 3 表达水平用胰蛋白酶消化培养在培养皿中的细胞株，1 000 r/min，5 min 离心收集细胞。弃上清，加入细胞裂解液，离心收集蛋白质。使用Bestrophin 3特异性一抗，二抗为标记有HRP 的抗体，采用免疫印迹法测定各细胞株中Bestrophin 3 的表达，选择β-actin 作为内标。

1.5 细胞水平检测不同细胞株Bestrophin 3 对甲强龙诱导的股骨头坏死的作用变化利用MTT 法检测细胞生存率，具体操作如下：（1）用培养基把细胞浓度调整至1 × 105个/mL，接种于96 孔板，每孔200 μL，置于5%二氧化碳、37 ℃培养箱中培养24 h；（2）从培养箱取出培养板，用Hank′s 液洗涤细胞2 次，每孔加入不同浓度的甲强龙细胞培养基（含10%胎牛血清），每孔100 μL，于5%二氧化碳、37 ℃培养箱继续培养24 h；（3）取出培养板后，每个培养孔加入5 mg/mL 的MTT 溶液20 μL，继续培养4 h；（4）倒掉孔中培养液，每孔加入MTT 裂解液100 μL，吹打混匀待完全溶解后，在波长490 nm处测OD值。相同方法检测甲强龙对人股骨头骨微血管血管内皮细胞的时间梯度损害（2、4、6、12、24 h）。

1.6 统计学方法实验数据均采用SPSS 23.0 统计软件进行分析，正态分布资料以表示，相关分析性分析采用Spearman 进行，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组受试者股骨头Bestrophin 3 水平比较观察组Bestrophin 3 表达水平高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05，图1）。

图1 两组受试者Bestrophin 3 水平比较Fig.1 Comparison of Bestrophin 3 levels between between observation group and control group

2.2 不同细胞株Bestrophin 3 的表达水平比较Western Blot 检测各细胞株Bestrophin 3 蛋白表达，结果见图2，细胞株C3（3.82 ± 0.95）的Bestrophin 3蛋白表达水平明显高于C1（2.57 ± 1.02），且C1 高于C2（0.97±0.26），差异有统计学意义（P＜0.05）。

图2 不同细胞株Bestrophin 3 表达水平比较Fig.2 Comparison of expression levels of Bestrophin 3 in the different cell lines

2.3 甲强龙诱导人股骨头骨微血管血管内皮细胞损害MTT 法检测可以反映存活细胞的数目，计算出甲强龙对人股骨头骨微血管血管内皮细胞杀伤后的细胞生存率。

2.3.1 MTT 方法比较不同浓度甲强龙对人股骨头骨微血管血管内皮细胞的毒性作用结果显示：不同浓度甲强龙对人股骨头骨微血管血管内皮细胞毒性之间存在着量效关系（P＜0.05）。当甲强龙浓度升高至0.02 mg/mL 时，各细胞株间细胞生存率差异有统计学意义（P＜0.05），浓度达10 mg/mL 时，细胞生存率差异有统计学意义（P＜0.01）。见图3。

图3 MTT 检测细胞生存率（甲强龙浓度曲线）Fig.3 MTT detection of cell survival rate（Methylprednisolone sodium succinate for injection concentration curve）

2.3.2 MTT 法比较甲强龙与人股骨头骨微血管血管内皮细胞不同孵育时间对细胞损害程度结果显示：甲强龙对人股骨头骨微血管血管内皮细胞毒性作用随着时间的延长而增强，两者存在时效关系（P＜0.05）。当作用时间达2 h 时，各细胞株间细胞生存率差异有统计学意义（P＜0.05），当作用时间达6 h 时，细胞生存率差异有统计学意义（P＜0.01）。同时可知，甲强龙毒性主要在6 h 作用时间内，当细胞与甲强龙孵育6 h 后细胞存活率只有35%，孵时间超过12 h 后细胞存活率只有20%，再延长孵育时间毒性作用不明显。当细胞株中高表达Bestrophin 3 基因后，细胞生存率也相应增加。见图4。

图4 MTT 检测细胞生存率（时间杀伤曲线）Fig.4 MTT detection of cell survival rate（Time kill curve）

2.4 Bestrophin 3 表达水平与细胞生存率相关性分析经Spearman 相关分析显示，细胞生存率与Bestrophin 3表达水平呈正相关，差异有统计学意义（r=0.836，P＜0.01）。

3 讨论

股骨头坏死是血液供应不足导致骨细胞死亡的结果，股骨头坏死的不均一性愈合是罕见的，并且取决于股骨头的受累程度而发生可变量的塌陷［8］。在成人中，股骨头重塑力不是无限的，当股骨头坏死到一定程度自身就不能修复到原本的状态，如股骨头坏死严重时会导致骨塌陷，最终引起股骨头变形，这种变化有不可逆性［9-10］。目前我国股骨头坏死患者高达500 ～750 万，且呈逐年增加的趋势［11］。股骨头坏死根据发病机制不同分为创伤性和非创伤性两大类［12］，目前临床上相对较多的是非创伤性股骨头，其发病机制较为复杂，主要与骨内微循环障碍和细胞凋亡相关，导致非创伤性股骨头坏死的因素包括激素、酒精、吸烟等，最重要的致病因素被认为是激素和酒精［13-14］。本研究集中在激素引起的股骨头坏死，有激素长使用史的患者体内脂代谢紊乱，机体会产生大量的凝血因子，凝血因子达到一定量后容易引发局部组织出现高凝现象或血管内凝血，进而引发缺血性股骨头坏死［15-16］。此外也有研究［17］发现，激素类药物能够引发血脂水平升高，导致血管内脂肪性栓塞，是静脉回流受阻，进而导致股骨头坏死。

Bestrophin 3 是bestrophin 氯离子通道家族的成员，其基因编码血管平滑肌细胞中cGMP 敏感的钙离子激活的氯离子通道［18］。 此外，因为Bestrophin 3 转录本在心脏组织中有高表达，所以假设Bestrophin 3 可能在心血管功能中起重要作用［19］。有研究［20］发现，Bestrophin 3 蛋白在心房和心室肌细胞以及肌纤维膜中均有分布，这一假设也得到了支持。董威等［2］研究发现股骨头坏死患者骨组织Bestrophin 3 mRNA 相对含量高于对照组。本研究通过分析就诊于本院患者的股骨头骨组织Bestrophin 3 相对含量，也发现观察组Bestrophin 3含量高于对照组，研究结果与［2］相符。董威等［9］通过构建股骨头坏死小鼠模型研究发现，模型组的Bestrophin 3 相对表达量显著高于空白组，且模型组丙二醛含量显著增加，超氧化物歧化酶含量显著减少，这两个因子均与氧化应激反应有关，因此Bestrophin 3 与小鼠体内氧化应激具有相关性。

目前对Bestrophin 3 研究主要集中于对氢化可的松诱导的人微血管内皮细胞损伤的保护作用以及在新生小鼠脑缺血缺氧时的保护作用［21-22］，其在股骨头坏死中是否有保护作用尚未可知。本研究室之前研究结果表明Bestrophin 3 在股骨头坏死小鼠中表达升高，但其作用以及作用机制尚不明确［2，9］。本研究构建了Bestrophin 3 不同表达量的细胞株，结果发现不同细胞株细胞生存率不同，Bestrophin 3 表达量升高细胞生存率相应提高，此研究结果表明Bestrophin 3 在内皮细胞损伤和皮质类固醇诱导股骨头坏死形成中的具有作用。为评估Bestrophin 3 是否可作为治疗皮质类固醇诱导骨头坏死的新靶点提供实验室依据。细胞生存率随着接触甲强龙时间延长其水平降低，Bestrophin 3的高表达可以缓解该降低水平，表明Bestrophin 3具有保护细胞的功能，能够缓解股骨头坏死中细胞的凋亡。

综上所述，Bestrophin3 在股骨头坏死患者骨组织中呈现高表达状况，高表达Bestrophin 3 对骨细胞具有保护作用，本研究可以为皮质类固醇诱导骨头坏死治疗的研究提供新思路。