短瓣金莲花化学成分与抑菌活性相关性研究

2019-11-13赵波李洪涛李鞠苏连杰

中医药信息 2019年6期

赵波,李洪涛,李鞠,苏连杰*

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨 150040;2.廊坊市中医医院，河北廊坊 065000)

毛茛科金莲花属(TrolliusL.)植物金莲花(TrolliuschinensisBunge)为多年生宿根草本植物，其花味苦、性寒、气芳香，具有清热解毒、止腐愈伤等功效，主治刃伤、疮殇多脓及咽喉肿痛等[1-2]。现代药学研究和临床应用表明，金莲花主要用于上呼吸道感染、咽炎、扁桃体炎和支气管炎[3]，具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤和抗氧化等活性，并在2003年被选为预防严重急性呼吸道综合征(SARS)疾病中的复合处方药物之一。由于金莲花所具有的良好生物活性及广泛应用，使其野生资源匮乏并遭到破坏，因此急需寻找其替代源药材，以拓展金莲花药材来源[4]。

短瓣金莲花(TrolliusledebouriReichb.)为金莲花同属植物，主要分布于黑龙江省及内蒙古东北部，在西伯利亚东部及远东地区也有分布，资源比较丰富。目前，已有学者对短瓣金莲花进行了初步化学研究，分离得到黄酮类、有机酸类和甾醇类等化合物，并进行了初步活性研究，发现其同样具有抗病毒、抗炎及抗氧化等生物活性[5]。笔者前期的研究工作表明，短瓣金莲花与金莲花的化学成分相当。为进一步确定短瓣金莲花能否替代金莲花成为一种安全、有效的临床新药源，本研究对短瓣金莲花进行了体内外抑菌活性研究，并初步探讨了其抑菌活性与化学成分的相关性。

1 仪器与材料

B-L系列分析天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；HH-S恒温水浴锅(江苏金坛县医疗仪器厂)；DHP-9162型电热恒温培养箱(上海一恒科技有限公司)；classⅡTYPE B2无菌操作台(北京东联哈尔仪器制造有限公司)；超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、沙门氏菌和志贺氏痢疾杆菌(黑龙江中医药大学微生物实验中心提供)；蛋白胨、琼脂粉和氯化钠(北京奥博星生物技术有限责任公司)；胰酶提取物；头孢氨苄(批准文号：H11020463);金莲花片(批准文号：Z13020456)。

昆明种小鼠，体质量(20±2.0)g，雌雄各半，清洁级，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供，合格证号：SYXK黑2015001。

短瓣金莲花和金莲花药材采自大兴安岭加格达奇，经黑龙江中医药大学苏连杰教授鉴定为TrolliusledebouriReichb.和TrolliuschinensisBunge。

荭草苷和牡荆苷单体自制，经HPLC测定纯度为99.98%。

2 方法与结果

2.1 体外抑菌试验

2.1.1 供试品的制备

精密称取干燥至恒重的短瓣金莲花和金莲花，70%乙醇回流提取，合并提取液减压回收至无醇味，得总提取物。上大孔树脂，用水、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇和95%梯度乙醇洗脱，减压回收洗脱液，用无菌水稀释至相当于生药量1 g/ml溶液，并按2、4、8、16倍稀释成4个浓度。

2.1.2 药敏纸片的制备

用打孔器将普通定性滤纸片用打孔器打成若干直径为6 mm的圆形纸片，置于干燥洁净的小锥形瓶中，封口，放入高压蒸气灭菌锅中，经121 ℃高压灭菌30 min，放冷，干燥。分别取干燥后的不同供试样品0.2 g，用水溶解至浓度为20 μg/mL，并按倍比稀释法稀释成5个不同的浓度，将滤纸片放入溶剂中，反复吸取，晾干，直至将溶剂吸干，用紫外灯照射灭菌10～15 min，备用。

2.1.3 培养基的制备

制备琼脂培养基。精密称取胰酶提物5 g，蛋白胨10 g，氯化钠10 g,向烧杯中依次加入蛋白胨、胰酶提物、氯化钠，加入1 000 mL蒸馏水，将烧杯放在加有石棉网的电炉上加热，边搅拌边加入1.2%的琼脂粉，加热至微沸透明。并补足由于蒸发而失掉的水分，用4%的NaOH调节pH值至7.2～7.4，过滤，均匀分装于500 mL锥形瓶中，然后放入121 ℃高压灭菌30 min，取出趁热倒入经过高压灭菌的培养皿中，厚度约3～5 mm，冷却凝固，备用。

2.1.4 菌悬液的制备

分别将菌株先接种于平板，在37 ℃培养箱中培养24 h后，挑选出各个菌株的典型菌落接种于25 mL琼脂培养基中，置37 ℃培养箱中培养18～24 h，取1 mL制备菌液用无菌生理盐水(0.9%)以10倍稀释法依次进行稀释，与麦氏比色管对比，调整其浊度至0.5麦氏比浊标准(即1.5×108cfu/mL)，备用。

2.1.5 抑菌活性的测定

采用滤纸片扩散法，用无菌移液管吸取稀释好的菌悬液0.1 mL，置于培养皿中央，倒入适量的琼脂培养液使菌悬液涂布均匀。用无菌镊子夹取含药滤纸片贴在培养基的表面，同时以含药量为0.02 mg/mL的头孢氨苄细菌药敏试纸为阳性对照，以无菌双蒸水浸泡过的滤纸片为阴性对照。将培养基放入37 ℃培养箱中培养24 h后取出观察抑菌圈，并用游标卡尺测量抑菌圈的大小，结果以毫米(mm)表示，并以此判断不同浓度供试品对供试菌的抑菌效果，每种不同浓度的供试品分别做3组平行对照，结果取平均值。具体见表1和表2。

注：与空白组比较，P<0.05，P<0.01，P<0.001。

表1及表2结果表明，与空白组比较，短瓣金莲花与金莲花总提物及不同洗脱部位对金黄色葡萄球菌等5种细菌均有不同程度的抑制作用，且以总提取物的抑菌效果最好；黄酮类单体化合物荭草苷和牡荆苷除对金黄色葡萄球菌和沙门氏菌无抑菌作用，对其他三种细菌均有较好的抑菌效果。说明短瓣金莲花与金莲花抑菌效果相当。

2.2 体内抑菌试验

2.2.1 感染菌液的制备

按“2.1.4”项操作，培养金黄色葡萄球菌，并将菌液按照麦氏计数法制成1011、1010、109、108、107、106、105、104cfu/mL浓度的菌液。

2.2.2 MLD(最小致死量)的确定

取体质量18～22 g的小鼠30只，分为6组，每组5只。分别腹腔注射不同浓度的细菌溶液(金黄色葡萄球菌)，注射量为0.5 mL/只，观察小鼠在4天内的死亡情况，得到最小致死量(MLD)，即感染后引起小鼠100%死亡率的菌液浓度。结果见表3，结果表明金黄色葡萄球菌对小鼠的最小致死量为1011cfu/mL。正式实验时，选定引起小鼠死亡率达80%～100%死亡的菌液浓度进行感染，即金黄色葡萄球菌为1010cfu/mL。

表3金黄色葡萄球菌对小鼠MLD的测定

组别菌液浓度(cfu/mL)剂量(ml/只)动物数(只)死亡数(只)死亡率(%)11×1070.5500 21×1080.55240.031×1090.55360.041×10100.55480.051×10110.555100.061×10120.555100.0

2.2.3 对小鼠感染致死性金黄色葡萄球菌的保护作用

取雌雄各半昆明种小白鼠90只，分为正常组、模型对照组(蒸馏水20 mL/kg)、金莲花片组(2.4 g/kg)和70%乙醇提取短瓣金莲花及金莲花总提取物低剂量(0.12 g/kg)、中剂量(0.24 g/kg)、高剂量(0.48 g/kg)组。每日给小鼠灌胃1次，连续3天。第3天给药后1 h腹腔注射最小致死量的细菌悬液0.5 mL/只作致死性攻击，感染小鼠后，每小时观察小鼠死亡情况，计算48 h小鼠死亡数，计算死亡率。结果见表4。

表4结果表明，模型对照组小鼠死亡率高达90.0%，与模型对照组比较，阳性对照组小鼠死亡率40.0%，体内抗菌疗效显著。短瓣金莲花与金莲花总提取物3个剂量组小鼠死亡率明显低于模型对照组(P<0.05)，并有一定剂量依赖关系。

表4短瓣金莲花提取物对感染小鼠死亡率的影响

组别剂量(g/kg)动物数(只)死亡数(只)死亡率(%)正常组—1000 模型对照组—10990.0金莲花片组2.410440.0金莲花总提组(低)0.1210760.0金莲花总提组(中)0.2410650.0金莲花总提组(高)0.4810440.0短瓣金莲花总提组(低)0.1210880.0短瓣金莲花总提组(中)0.2410770.0短瓣金莲花总提组(高)0.4810550.0