中兽药乌梅颗粒质量标准的研究

张远达，陈志强，尚静雪，蔡小利，战 文，张鹏举，付丽云，李海华

(内蒙古华天制药有限公司，内蒙古赤峰市，024070)

乌梅颗粒由乌梅、柿饼、黄连、姜黄、诃子组成。原方乌梅散收载于《中国兽药典》二部[1]，临床应用于治疗幼畜奶泻。但由于散剂服用剂量大，服用不便，且药材中的有效成分不易溶出，吸收差[2]。故对乌梅散进行工艺研究将其制成颗粒剂。为控制乌梅颗粒的质量，本文对其进行质量研究，复方中乌梅为制剂的君药，含有大量的有机酸，现代药理研究表明，乌梅的抗菌和固涩作用与有机酸密切相关[4]，因此将有机酸中含量最高的柠檬酸作为复方的有效成分之一。研究建立了高效液相色谱法测定乌梅颗粒复方中柠檬酸的含量，并在保留原方中黄连的鉴别方法基础上又增加了乌梅的薄层色谱法进行定性鉴别。实验证明，该方法简便、准确，为乌梅颗粒的质量控制提供了依据。

1 仪器与材料

LC-2010CHT高效液相色谱仪(日本岛津公司)；集热式磁力加热搅拌器(型号为DF-101S)，金坛市瑞华仪器有限公司生产；旋转蒸发仪(型号为RE52-99)、循环水式真空泵(型号为SHZ-Ⅲ)，上海亚荣生化仪器厂生产；电子天平(BT25S)；青岛海洋化工厂硅胶G薄层板。

乌梅颗粒：批号：180601-180607，来源：内蒙古华天制药有限公司研制。乌梅对照药材：规格：5 g；批号:121208-201506；供TLC含量测定比色检查用，使用前不需要干燥处理；来源：中国食品药品检定研究院。黄连对照药材：规格：1 g；批号: Z0010704；供TLC含量测定比色检查用，使用前不需要干燥处理；来源：中国兽医药品监察所。盐酸小檗碱对照品：规格：30 mg；批号: 110713-201613；含量：86.8%；来源：中国食品药品检定研究院。枸橼酸对照品：规格：200 mg；批号: 100396-201603；含量：100.0%；来源：中国食品药品检定研究院。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别

2.1.1 阴性对照溶液制备 根据处方去除各味药，按制剂工艺制成相应阴性对照，并按各自供试品溶液制备方法制成相应溶液，即得[3]。

2.1.2 乌梅薄层色谱鉴别 取乌梅颗粒样品粉末20 g，加甲醇30 mL，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加水20 mL使溶解，加乙醚振摇提取2次，每次20 mL，合并乙醚液，蒸干，残渣用石油醚(30～60℃)浸泡2次，每次15 mL(浸泡约2 min)，倾去石油醚，残渣加无水乙醇2 mL使溶解，作为供试品溶液。另取乌梅对照药材5 g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述供试品溶液10 μL和对照药材溶液5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环已烷-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(20∶5∶8∶0.1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色，置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。结果见图1。由图可知，供试品色谱在与对照药材色谱相应位置上显相同颜色的斑点，特征性强，阴性无干扰。

1、6乌梅对照药材 2、3、4供试品溶液 5阴性对照溶液1、6 wumei control herbs 2、3、4 test solution 5 negative control solution图1 乌梅TLC色谱图Fig. 1 TLC chromatogram of Wumei

2.1.3 黄连薄层色谱鉴别 取乌梅颗粒样品0.5 g，加甲醇10 mL，超声15 min，滤过，滤液浓缩至5 mL，作为供试品溶液。另取黄连对照药材50 mg，加甲醇5 mL，超声15 min，滤过，滤液作为对照药材溶液。再取盐酸小檗碱对照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述三种溶液各2 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以苯-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-水(6∶3∶1.5∶1.5∶0.3)为展开剂，置氨蒸汽饱和的展开缸内，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应位置上，显相同的黄色荧光斑点；在与对照品色谱相应的位置上，显相同的一个黄色荧光斑点。结果见图2。由图可知，供试品色谱在与各对照品色谱相应位置上显相同颜色的斑点，特征性强，阴性无干扰。

1盐酸小檗碱对照品 2黄连对照药材3阴性对照溶液4、5 供试品溶液1 berberine hydrochloride control 2 rhizoma coptidis control3 negative control solution 4, 5 test solution图2 黄连TLC色谱图Fig 2 TLC chromatogram of rhizoma coptidis

2.2 HPLC定量测定

2.2.1 色谱条件 Silgreen C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相为乙腈-0.5%磷酸二氢铵溶液(3∶97)(用磷酸调节pH值至3.0)；检测波长为210 nm；流速为0.6 mL/min；柱温为30℃。含量测定结果采用外标法计算。

2.2.2 对照品溶液的制备 取枸橼酸对照品适量，精密称定，加水制成每1 mL含0.5 mg的溶液，即得。

2.2.3 供试品溶液制备 取本品约1 g，精密称定，精密加入水50 mL，称定重量，加热回流1 h，放冷，再称定重量，用水补足减失的质量，过滤，取上清液，即得。

2.2.4 方法学考察

2.2.4.1 专属性考察 如图3所示，阴性对照在对照品相同保留时间处未出现对应色谱峰，表明阴性无干扰。

2.2.4.2 线性关系考察 精密量取枸橼酸对照品溶液10 mL，置于50 mL量瓶中混匀，用水定容至刻度，再将其倍半稀释为6个质量浓度，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定。以峰面积为纵坐标 (Y)，质量浓度为横坐标(X)进行线性回归，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

图3 对照色谱图Fig 3 Controast chromatogram

表1 枸橼酸线性关系Tab 1 linear relationship of citric acid

2.2.4.3 稳定性试验 取供试品溶液(批号180601)，于0、2、4、8、10、12 、24 h在 “2.2.1”项色谱条件下进样10 μL测定，测得枸橼酸面积RSD分别为0.40%、0.57%、0.82%、0.91%、2.35%、2.91%，表明供试品溶液在12 h 内稳定性良好。

2.2.4.4 精密度试验 精密吸取供试品溶液(批号180601)10 μL，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定6次，测得枸橼酸面积RSD分别为0.31%、0.96%、0.22%、0.12%、0.68%，表明仪器精密度良好。

2.2.4.5 重复性试验 取样品(批号180601)6份，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.2.1”项色谱条件下进样10 μL测定，测得枸橼酸含量RSD分别为0.40%、0.89%、0.33%、1.09%、1.15%，表明该方法重复性良好。

2.2.4.6 加样回收率试验 取已知枸橼酸含量的乌梅颗粒供试品溶液6份，分别精密加入对照品溶液，摇匀，按照上述色谱条件，10 μL进样测定峰面积，计算得平均回收率为99.21%，RSD为1.52%。见表2。

表2 回收率实验结果Tab 2 Experimental results of recovery rate

2.3 样品含量测定 取6批样品，按上述“2.2.3”项下方法测定含量，结果分别为0.18%、0.16%、0.14%、0.14%、0.12%、0.15%，可知6批样品枸橼酸平均含量为0.15%。

3 讨论与结论

幼畜奶泻的中兽医治疗原则主要以清热解毒，涩肠止泻为主[9]，原方“乌梅散”来自于经典名方，乌梅颗粒即改变乌梅散的制备工艺，使其在应用、储存、交通中达到更好的效果。乌梅颗粒中乌梅、黄连等中药均有止泻、清热解毒的作用，在制备工艺中将乌梅颗粒进行提取、浓缩、制粒，使其质量可控。

乌梅颗粒原标准以黄连的薄层色谱定性鉴别作为其质量控制依据，为进一步完成检测的精密度准确性故本实验增加了TLC、HPLC 法检测完善了质量标准。在TLC定性鉴别中，本实验不仅保留原标准黄连的鉴别，还增加了乌梅鉴别及含量测定的方法：薄层色谱定性鉴别测定中，黄连参照原标准检测结果符合规定。新增的乌梅鉴别参照《兽药典》的检测方法，但因本方为复方制剂，成分复杂，经研究将结果拟定为喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色，置紫外光灯(365 nm)下检视，供试品色谱中，在与乌梅对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。根据陈琳[10]等人实验结果，本研究将枸橼酸作为复方制剂质量控制指标，并参照《中国兽药典》中乌梅含量测定项下的检测方法，但因本方是由5味中药组成的复方制剂，成分复杂，测定时干扰严重，故本研究将检测流速设定为0.6 mL/min，并通过方法学研究对其专属性、线性、稳定性、精密度、重复性和加样回收率进行考察，最终测定的6批样品其平均值为0.15%，最小值为0.12%。

研究建立了乌梅颗粒复方制剂中乌梅与黄连的薄层鉴别方法和枸橼酸含量测定方法，说明乌梅颗粒的质量可控，且方法简便准确、专属性强、准确度高，可用于乌梅颗粒的质量控制，为其复方制剂的质量控制提供了依据。