龙眼肉水提物对小鼠抗疲劳及耐缺氧作用实验研究

郭超萍，张 兵，包传红*

(1.玉林市中医医院，广西 玉林 537000；2.广西中医药大学，广西 南宁 530200)

疲劳在中医学中属于“虚”“虚损”“虚劳”等范畴，疲劳的病机主要是气血失常和五脏的功能失调。李中梓提出《内经》所说的虚劳分为气虚、血虚两个方面。也就是由于大负荷量运动能损耗机体精气血津液和能量物质，累及心肝脾肾等脏腑，导致运动能力下降[1]。龙眼肉，为无患子科植物龙眼DimocarpuslonganLour.的假种皮[2]。具有补益心脾、养血安神之功效，常用于气血不足、心悸怔忡、健忘失眠、血虚萎黄等症的治疗。现代药理研究证实龙眼肉具有抗氧化、增强机体免疫力[3-4]、抗衰老[5]、抗痴呆[6]、保护神经细胞的作用[7]。龙眼肉既可以补益心脾之气，又可以养心肝之血，符合中医治疗虚劳的理论，再结合疲劳的产生与氧化应激之间存在很大关系[8]的基础上，本实验用龙眼肉水提物通过小鼠负重游泳和耐缺氧实验，检测各项抗疲劳、抗氧化的指标，探讨龙眼肉水提物的抗疲劳和耐缺氧的作用机制，以期为其临床用于虚证提供实验依据。

1 材料

1.1 动物

SPF级昆明种小鼠，雌雄各半，体重(20±2)g，由广西医科大学提供，许可证号：SCXK：桂2013-0003。

1.2 药品和试剂

龙眼肉(广西柳州百草堂中药饮片厂有限责任公司)；红景天胶囊(北京同仁堂有限公司)；钠石灰(上海五四化学试剂有限公司)；尿素氮试剂盒、肝糖元试剂盒、乳酸试剂盒、乳酸脱氢酶试剂盒(南京建成生物工程研究所)；超氧化歧化酶试剂盒和丙二醛试剂盒(武汉华美工程公司)。

1.3 仪器

游泳箱(50 cm×50 cm×40 cm)；电子分析天平(德国赛多利斯，型号：BSA224S)；高速离心机(Thermo Fisher，型号：ST16)；电热恒温水浴锅(江苏省金坛市医疗仪器厂，型号：HHS-8) ；全自动动物生化分析仪(美国拜谱有限公司，型号：Trilogy) ；铅皮。

2 方法

2.1 药物制备

取龙眼肉加入纯水加热提取3次，合并提取液，浓缩至0.45 g/mL。

2.2 动物分组与给药

选取50只SPF级小鼠，随机分为正常对照组、红景天胶囊(600 mg·kg-1)和龙眼肉水提物高(9 g·kg-1)、中(4.5 g·kg-1)、低(2.25 g·kg-1)剂量组，每组10只。分别灌胃红景天胶囊及龙眼肉水提物，正常对照组灌胃等容量生理盐水，每日1次，20 mL·kg-1，连续30 d。

2.3 小鼠负重游泳实验[9]

最后1次给药后次日将小鼠置游泳箱(50 cm×50 cm×40 cm)中游泳。水温(25±1)℃，水深不少于30 cm，小鼠尾根部负荷5%体重的铅皮。以小鼠全身没于水面以下，8 s内不能浮出水面即为力竭，记录开始游泳至力竭的时间，为力竭游泳时间。

2.4 小鼠常压耐缺氧实验[10-11]

最后1次给药后分别将小鼠放入盛有10 g钠石灰的容量为250 mL磨口瓶内，加上盖子密封。观察其存活时间，以呼吸停止为死亡指标。

2.5 血清乳酸(BLA)和乳酸脱氢酶(LDH)测定

小鼠末次给药30 min后采血，然后不负重在温度为30 ℃的水中游泳10 min后停止，游泳后采血进行LA和LDH测定。

2.6 血清尿素(BUN)测定

小鼠末次给药30 min后，在温度为30 ℃的水中游泳90 min，休息60 min后立即摘眼球采血，离心后吸取血清参照试剂盒说明书操作，于生化分析仪上测定血清BUN含量。

2.7 小鼠血清超氧化歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)含量测定

小鼠末次给药30 min后，取血采用ELISA法检测小鼠血清SOD含量和MDA含量。

2.8 统计学方法

数据采用SPSS 19.0 for Windows 统计软件分析，组间采用单因素方差分析，各组之间两两比较采用LSD检验，P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 各组小鼠力竭游泳时间与耐缺氧时间测定结果

由表1可知，阳性对照组与各剂量组小鼠负重游泳时间和耐缺氧时间均比正常对照组长；与正常对照组对比，阳性对照组及高剂量组有非常显著性差异(P<0.01)，中剂量组有显著性差异(P<0.05)，低剂量组与正常对照组相比无显著差异(P>0.05)。对于耐缺氧时间，阳性对照组与各剂量组小鼠耐缺氧时间均比正常对照组长，阳性对照组及高剂量组与正常对照组对比，有非常显著性差异(P<0.01)，与中及低剂量组相比有显著性差异(P<0.05)。

组别剂量力竭游泳时间(min)耐缺氧时间(min)正常对照组-17.66±2.9029.13±3.50红景天胶囊组600mg·kg-123.16±2.51∗∗36.94±3.79∗∗高剂量组9g·kg-121.63±2.52∗∗34.16±3.46∗∗中剂量组4.5g·kg-120.52±2.25∗32.92±2.27∗低剂量组2.25g·kg-118.58±2.2232.15±2.63∗

注：与正常对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。

3.2 各组小鼠抗疲劳指标检验结果

由表2可知，阳性对照组与龙眼肉水提物各剂量组的尿素氮明显低于正常对照组，但肝糖原含量显著高于正常对照组。对于尿素氮，与正常对照组对比，阳性对照组及高剂量组有非常显著性差异(P<0.01)，中剂量组有显著性差异(P<0.05)；对于肝糖原，阳性对照组及高剂量组的肝糖原含量与正常对照组对比，有非常显著性差异(P<0.05)，中剂量组有显著性差异(P<0.05)，低剂量组的肝糖原含量与空白对照组相比无显著性差异。

组别剂量尿素氮(mmol/L)肝糖原(mg/g)正常对照组-14.23±1.9210.92±2.13红景天胶囊组600mg·kg-18.59±1.28∗∗14.75±2.17∗∗高剂量组9g·kg-19.97±1.02∗∗13.81±2.27∗∗中剂量组4.5g·kg-112.05±1.68∗13.14±2.53∗低剂量组2.25g·kg-112.47±1.4011.72±1.22

注：与正常对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。

由表3可知，阳性对照组与龙眼肉水提物各剂量组游泳后乳酸的含量与正常对照组明显降低，乳酸脱氢酶活力与正常对照组明显升高。对于乳酸含量，与正常对照组对比，阳性对照组及高剂量组有非常显著性差异(P<0.01)，中剂量有显著性差异(P<0.05)；对于乳酸脱氢酶，阳性对照组及高剂量组的肝糖原含量与正常对照组对比，有非常显著性差异(P<0.05)，中剂量组有显著性差异(P<0.05)，低剂量组与正常对照组相比无显著性差异。因此结果表明，龙眼肉水提物能提高LDH的活性，加快清除无氧糖酵解所生成的乳酸，从而减少乳酸在体内堆积，延缓疲劳的产生或加速疲劳的消除。

组别剂量乳酸(mmol/L)乳酸脱氢酶(U/L)正常对照组-10.84±1.2010.62±1.54红景天胶囊组600mg·kg-17.93±0.86∗∗14.14±1.90∗∗高剂量组9g·kg-19.12±1.05∗∗13.09±1.72∗∗中剂量组4.5g·kg-19.17±1.04∗∗12.57±1.92∗低剂量组2.25g·kg-110.05±1.3112.25±1.81

注：与正常对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。

3.3 龙眼肉水提物对小鼠血清SOD、MDA含量的影响

由表4结果可知，红景天胶囊组、龙眼肉水提物高、中剂量组的SOD含量明显升高，与正常对照组比较有非常显著性差异(P<0.05)，而龙眼肉水提物低剂量组无显著性差异(P>0.05)。与正常对照组相比，西洋参口服液组、龙眼肉水提物高、中剂量组MDA水平明显降低，有非常显著性差异(P<0.01)，中剂量组MDA水平与正常对照组相比有显著性差异(P<0.05)。

组别剂量SOD(pg·mL-1)MDA(pmol /L)正常对照组-206.41±17.75∗∗692.62±73.41红景天胶囊组600mg·kg-1235.37±21.68∗∗545.91±66.94∗∗高剂量组9g·kg-1225.98±13.06∗577.09±69.98∗∗中剂量组4.5g·kg-1220.67±10.65∗606.89±68.59∗低剂量组2.25g·kg-1209.47±10.20608.16±759.49

注：与正常对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。

4 讨论

负重游泳实验和常压缺氧实验可以反映在环境供氧缺乏和自身耗氧量增加的情况下，机体抗疲劳及耐缺氧的能力，因此常被用于研究药物的抗疲劳和耐缺氧作用[11-12]。实验结果表明，龙眼肉水提物能明显延长小鼠负重游泳时间和小鼠在常压缺氧状态下的存活时间，说明龙眼肉水提物具有增强小鼠抗疲劳和耐缺氧的能力。在反映疲劳的生化指标中，血清尿素氮、乳酸水平、肝糖原含量生化指标的改变比较明显，也是检测疲劳最常用的指标[13]。运动后血清尿素氮的多少提示机体利用蛋白质供能的多少，间接反映机体的疲劳程度，也是检测疲劳的理想指标[14]。糖原是运动中最重要的能源物质，机体剧烈运动后大量糖原被消耗，因此糖原储备可作为评价机体抗疲劳的另一重要指标[15]。结果表明，龙眼肉水提物能降低运动后血清尿素的增量，显著增加运动小鼠肝糖原的储备。SOD是体内清除自由基的重要抗氧化酶，它可以催化O2-歧化反应生成H2O2。MDA作为一种脂质过氧化产物，它可以反映出组织氧化的程度水平，实验结果显示龙眼肉水提物能水平升高SOD的水平，减少MDA的生成。

龙眼肉水提物抗疲劳的作用机制可能与其增加力竭游泳过程中肝糖原的储备，降低代谢产物BUN、LA 及MDA的水平，提高 SOD及LDH活性，加速氧自由基的清除，增强了小鼠的抗氧化能力，从而减轻机体的氧化损伤，调节整个机体代谢状态，最终提高小鼠的运动能力，起到抗疲劳作用。