高效液相-串联质谱法测定猪肉中7种青霉素残留量

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青霉素是含有β-内酰胺基母核结构的一种抗生素,是兽医临床重要的抗生素之一[1]。青霉素类药物的作用特点是通过抑制细菌黏肽转肽酶的活性,阻止细胞壁的合成,从而起到杀菌作用[2]。在动物饲养过程中,该药物主要用于治疗动物的尿道、胃肠道、呼吸道和生殖及皮肤病毒感染的治疗与预防,青霉素族药物在动物源性食品中的残留，会破坏人体肠道正常菌群环境,从而降低免疫力,给人的健康带来危害[3]。

目前，用于动物源性食品中青霉素族检测的方法，主要有微生物法及仪器测定法。微生物法是通过对特异微生物的生理机能、繁殖代谢的抑制作用实现对化合物的定性和定量，其缺点是专一性差，残留量误差也较大[4，5]。而以碳纳米管为电极的电化学免疫法[6，7]，与酶联免疫法[8]的测定结果也是。液相色谱法仅仅适用于基质比较干净的样品，对于基质复杂的样品分析时，往往难于定量[9]。为此建立液相色谱-串联质谱法测定猪肉中的青霉素残留量，由于该方法具有良好的适用性、定性分析和定量计算功能及具有较高灵敏度，成为测定畜产品中7种青霉素类药物残留量的主要方法[10～12]。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 6470液质联用仪、氮吹仪(Organomation N-EVAP)、涡旋混合器(IKA)、电子天平(METTLERAE100)、高速离心机(湖南湘仪H2050R)、Milli-Q超纯水器(Milli-Q,美国)；Atlantis dC18色谱柱(2.1×150mm,3m)色谱柱、Waters Oasis HLB固相萃取柱(6cc/500mg)。

阿莫西林(Amoxicillin纯度98.70%)、氨苄西林(Ampicillin纯度99.00%)、萘夫西林(Nafcillin纯度99.9%)、苯唑西林(Oxacillin纯度98.50%)、双氯西林(Dicloxacillin纯度97.27%)、氯唑西林(Cloxacillin纯度98.96%)和青霉素V(PenicillinV纯度98.6%)。

1.2 溶液的配制

标准储备溶液(1.0mg/mL)：准确称取10mg标准品物质，用乙腈水(3+7)溶解后定容至10mL，置于-18C冰箱冷藏保存。

1.3 试验方法

称取5g试样(精确到0.01g)置于50mL离心管中，加入10mL乙腈，均质30s，7 000r/min离心5min，取上清液至50mL离心管。再加入5mL乙腈再涡旋混合1min，离心，合并上清液，氮吹干，加入10mL 0.5%乙酸-50g/L钨酸钠的混合提取液，混匀器振荡混匀1min。以1mL/min的速度通过预处理的OasisHLB固相萃取柱(用5mL甲醇，5mL水活化)中，用5mL含体积分数5%甲醇淋洗，然后用5mL乙腈洗脱，收集洗脱液于样品管中，45C氮吹干，用2mL水溶解，供液相色谱-串联质谱仪测定。

1.4 高效液相色谱及质谱条件

1.4.1 色谱条件

流动相:0.1mol/L。

甲酸水溶液：0.1%甲酸乙腈=90∶10(v/v)。

梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序

1.4.2 质谱条件

电离源模式：电喷雾离子源(electrospray ionization, ESI)。

电离源极性：正模式(ESI+)。

检测方式：多反应监测(MRM)。

电喷雾电压：3 500V。

鞘气温度：350℃。

鞘气流速：11L/min。

干燥气流速11L/min。

干燥气温度：300℃。

其他质谱参数见表2。

表2 7种化合物的质谱分析参数

注：*定量离子。

2 结果与讨论

2.1 前处理及检测条件的选择

2.1.1 流动相和色谱柱的选择

根据已有的有关青霉素标准，采用了几种不同流动相及不同的色谱柱进行实验。首先流动相分别选用了0.1mol/L甲酸水溶液+0.1%甲酸乙腈、0.3mol/L乙酸水溶液+0.3%乙酸乙腈。采用0.1mol/L甲酸水溶液+0.1%甲酸乙腈出峰时间稳定，7种青霉素的相应强度也很好；而采用0.3mol/L乙酸水溶液+0.3%乙酸乙腈出峰时间会偏移，且对个别青霉素的相应强度比较低。因此选用0.1mol/L甲酸水溶液+0.1%甲酸乙腈。色谱柱经过实验对比采用Atlantis dC18色谱柱(2.1150mm,3m)，出峰时间合理，以MS采集数据，见图1。

图1 7种青霉素标准溶液的总离子流图Figure 1 Total ion -current chromatogram of 7 penicillin Standards

在选用固相萃取柱方面，主要考察了2种小柱分别是Oasis C18固相萃取柱和Oasis HLB固相萃取柱。采用C18固相萃取柱时阿莫西林峰易干扰，总体回收率偏低，特别是对在低酸度和高酸度条件下会快速降解[13]。而选用Oasis HLB固相萃取柱时各种物质出峰都比较好，回收率满足试验要求。

2.2 线性响应试验结果

将7种青霉素标准溶液，按检出限用水稀释成相应浓度，以定量离子色谱图中各组分的峰面积定量。绘制物质标准曲线，7种目标化合物的线性回归方程和相关系数见表3。

表3 7种化合物的回归方程

2.2.1 方法的回收率及精密度

向阴性的猪肉样品基质中分别添加检出限的1倍、2倍、10倍3个浓度水平的7种青霉素混合标准溶液，分别平行测定6次，计算各种化合物的回收率的算术平均值和相对标准偏差，结果见表4。

表4 精密度和回收试验结果(n=7)

2.3 质谱图分析

经过一系列条件的优化最终呈现7种青霉素的MRM峰型合理,相应强度也高，需要特别关注的是青霉素V的出峰位置有一个干扰峰是氨苄西林，氨苄西林的出峰时间为7.0min而青霉素V的出风时间在9.6min左右,其他6个目标峰处均无杂质峰干扰，分离度高，方法专属性良好，具体MRM图见图2。

图2 7种青霉素的MRM质谱图Figure 2 MRM Spectrograms of 7 Penicillins

3 结论

3.1 提取液和固相萃取柱的选择

实验过程中采用了3种提取液分别选用了：(1)0.15mol/L的磷酸二氢钠缓冲盐[14];(2)乙腈水(15+2)和0.05mol/L磷酸氢二钾[15];(3)纯乙腈和0.5%乙酸-50g/L钨酸钠的混合提取液。

实验发现采用3.1(1)的提取液在过固相萃取柱时容易堵塞、信号相应低、基质效应大、在氨苄西林出峰的位置会有一个干扰峰，因此该提取液不适用；采用3.1(2)提取液提取时先用乙腈水提取在旋转蒸发，过程中一方面液体容易产生泡沫喷出来，再用0.05mol/L磷酸氢二钾溶解时回收率差只有20%～50%之间，样品平行性差不能满足实验要求；用3.1(3)提取液是乙腈能很好的提取样品中青霉素物质，在氮吹过程中也能克服起泡沫反喷的现象，用0.5%乙酸-50g/L钨酸钠溶解比较完全，回收率在65.10%～101.12%之间，样品平行性好，因此最终选用乙腈和0.5%乙酸-50g/L钨酸钠的混合提取液作为提取液。

3.2 固相萃取柱的洗脱剂和溶解液

试验考察了甲醇、乙腈水(1+1)、乙腈溶液作为固相萃取洗脱剂的效果。用甲醇时发现氯唑西林在甲醇中会快速降解，降解产物以酯类物质为主对质谱电喷雾离子化有影响[16]；采用乙腈水(1+1)时氮吹太慢，最终定容比较困难；用乙腈是不仅缩短实验时间，对物质也能很好地保留。溶解液选用纯水和磷酸盐缓冲溶液，发现用纯水时物质相应比较高，基质比较低，峰型好看；采用磷酸盐缓冲溶液相应低，杂质峰多，峰型偏胖。

本试验采用了超高效液相色谱-串联质谱技术建立了动物源性食品中7种青霉素的高效液相-质谱检测方法。该方法前处理简便、线性良好、具有较高的平行性，可满足国家标准检测的要求，为相关部门风险监测提供了方法学依据。