甘草水提后药渣的化学成分及抗氧化活性研究

2019-11-09赵森铭李慧晓张志超辛爱玲马斌

广东药科大学学报 2019年5期

赵森铭，李慧晓，张志超，辛爱玲，马斌

(1.洛阳市食品药品检验所中药室，河南洛阳 471023； 2.洛阳市中心血站检验科，河南洛阳 471000； 3.山东大学药学院分析测试中心，山东济南 250100 )

甘草是豆科植物乌拉尔甘草GlycyrrhizauralenssisFish.、胀果甘草GlycyrrhizainflateBat.和光果甘草GlycyrrhizaglabraL.的干燥根和根茎[1]，是常用中药材。长期以来，医药企业采用水提、含水醇提、碱提等方法从甘草药材中仅提取主要药效成分——甘草酸，提取后的药渣则直接作为工业废料丢弃[2]。每年甘草制剂及其提取物的甘草消耗量巨大，由此产生的药渣往往直接被填埋，是一种极大的资源浪费。

近几年来，有学者将研究目标开始转向甘草药渣，如刘芬等[3]研究表明甘草药渣具有良好的抗氧化活性，但目前的研究多集中在粗提取物或者少数几个黄酮类成分[3-5]。因此，为进一步明确甘草药渣的化学成分，进而明确甘草药渣中的抗氧化活性成分，本文采用与工业上一致的方式提取的甘草药渣(即药材先用水煎煮2次，提取后的药材即为甘草药渣)，用体积分数95%乙醇提取其脂溶性成分，进一步对乙醇提取物进行提取分离，从中分离鉴定得到了10个化合物，并进行抗氧化活性测试。

1 仪器与试药

1.1 试药

甘草于2017年12月购于宁夏，经河南中医药大学李然教授鉴定为豆科植物乌拉尔甘草(GlycyrrhizauralensisFisch.)的干燥根及根茎。ODS-C18 填料(苏州本草天成生物技术公司)；Sephadex LH-20凝胶(美国GE公司)；柱色谱硅胶100～200目、200～300目(青岛海洋化工厂)；薄层层析硅胶板(HSGF254，烟台江友硅胶开发有限公司)；其他试剂(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)。

1.2 仪器

Bruker AVANCE III 500核磁共振仪(德国布鲁克公司)；QTrap 4500+型质谱仪(加拿大AB SCIEX)；Shimadzu LC-20AB高效液相色谱仪、DAD检测器(日本岛津公司)；LC-20AT半制备高效液相色谱仪(美国Kromsil公司250 mm×10 mm，5 μm；制备柱)。

2 提取与分离

甘草药材(30 kg)，加入8倍量水加热回流提取2次，每次3 h。药材残渣再用体积分数95%乙醇加热回流提取2次，每次3 h，过滤合并滤液减压回收乙醇至无醇味。流浸膏加水悬浮后依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取2次，减压回收，最终得到乙酸乙酯部位185.73 g。乙酸乙酯部位首先经减压硅胶柱层析(200～300目)，用二氯甲烷-甲醇梯度洗脱(100∶0、90∶10、80∶20、70∶30、50∶50、0∶100)，得到6个洗脱部位，分别为Fr1～Fr6。Fr2(65.72 g)经ODS反相中压柱层析，依次用甲醇-水梯度洗脱得到Fr2.1～Fr2.7；Fr2.2(17.33 g)用Sephadex LH-20凝胶柱色谱(MeOH)和半制备液相色谱分离纯化得到化合物1(55 mg)、化合物9(153 mg)、化合物10(306 mg)；Fr2.3(14.29 g)同样用Sephadex LH-20凝胶柱色谱(MeOH)和半制备液相色谱分离纯化得到化合物3(272 mg)、化合物4(37 mg)、化合物7(48 mg)、化合物8(97 mg)；Fr2.4(15.40 g)同样用Sephadex LH-20凝胶柱色谱(MeOH)和半制备液相色谱分离纯化得到化合物2(351 mg)、化合物5(13 mg)、化合物6(26 mg)。

3 结构鉴定

化合物1：黄色针晶(吡啶)，mp 256～258 ℃，ESI-MSm/z: 269 [M+H]+，分子式C16H12O4(不饱和度Ω=11)。1H-NMR(DMSO-d6，500 MHz)δ：8.29(1H，s，H-2)，7.93(1H，d，J=9.5 Hz，H-5)，7.45(2H，d，J=9.0 Hz，H-2′，6′)，6.98(2H，d，J=9.0 Hz，H-3′，5′)，6.90(1H，dd，J=9.5，2.0 Hz，H-6)，6.87(1H，d，J=2.0 Hz，H-8)，3.69(3H，s，4′-OCH3)。13C-NMR(DMSO-d6，125 MHz)δ：152.8(C-2)，124.0(C-3)，174.3(C-4)，116.3(C-5)，114.7(C-6)，162.3(C-7)，101.9(C-8)，158.7(C-9)，127.0(C-10)，122.9(C-1′)，128.8(C-2′)，113.2(C-3′)，157.1(C-4′)，113.3(C-5′)，130.0(C-6′)，54.9(4′-OCH3)。以上数据与文献[6]报道基本一致，故鉴定该化合物为芒柄花素(Formononetin)。

化合物2：淡黄色粉末(吡啶)，mp 180～182 ℃，ESI-MSm/z: 353 [M+H]+，分子式C20H16O6(不饱和度Ω=13)。1H-NMR(DMSO-d6，500 MHz)δ：12.95(1H，s，5-OH)，11.03(1H，s，7-OH)，8.23(1H，s，H-2)，6.87(1H，d，J=2.0 Hz，H-2′)，6.67(1H，d，J=2.0 Hz，H-6′)，6.29(1H，d，J=10.5 Hz，H-4″)，6.23(1H，d，J=1.5 Hz，H-8)，6.08(1H，d，J=1.5 Hz，H-6)，5.69(1H，d，J=10.5 Hz，H-3″)，1.32(6H，s，H-5″，6″)。13C-NMR(DMSO-d6，125 MHz)δ：157.4(C-2)，122.6(C-3)，179.4(C-4)，161.7(C-5)，99.4(C-6)，165.7(C-7)，93.9(C-8)，157.4(C-9)，103.6(C-10)，120.0(C-1′)，117.3(C-2′)，144.8(C-3′)，153.6(C-4′)，116.8(C-5′)，139.7(C-6′)，75.7(C-2″)，131.0(C-3″)，121.8(C-4″)，27.4(C-5″)，27.4(C-6″)。以上数据与文献[7]报道基本一致，故鉴定该化合物为半甘草异黄酮B(Semilicoisoflavone B)。

化合物3：白色粉末(吡啶)，mp 265～266 ℃，ESI-MSm/z: 447 [M+H]+，分子式C22H22O10(不饱和度Ω=12)。1H-NMR(C5D5N，500 MHz)δ：13.4(1H，s，5-OH)，8.14(1H，s，H-2)，7.68(2H，d，J=9.0 Hz，H-2′，6′)，7.07(2H，d，J=9.0 Hz，H-3′，5′)，6.93(1H，s，H-8)，6.85(1H，s，H-6)，5.78(1H，d，J=7.5 Hz，glc-H-1)，3.71(3H，s，4′-OCH3)。13C-NMR(C5D5N，125 MHz)δ：153.9(C-2)，121.0(C-3)，181.0(C-4)，162.8(C-5)，100.5(C-6)，163.4(C-7)，95.0(C-8)，157.8(C-9)，107.1(C-10)，122.6(C-1′)，130.5(C-2′)，114.1(C-3′)，160.0(C-4′)，114.1(C-5′)，130.5(C-6′)，101.5(glc-C-1)，74.5(glc-C-2)，78.1(glc-C-3)，70.9(glc-C-4)，78.9(glc-C-5)，62.1(glc-C-6)，55.1(4′-OCH3)。以上数据与文献[8]报道基本一致，故鉴定该化合物为5，7-二羟基-4′-甲氧基异黄酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(Sissotrin)。

化合物4：白色针晶(吡啶)，mp 216～217 ℃，ESI-MSm/z: 431 [M+H]+，分子式C22H22O9(不饱和度Ω=12)。1H-NMR(DMSO-d6，500 MHz)δ：8.25(1H，s，H-2)，8.07(1H，d，J=9.5 Hz，H-5)，7.45(2H，d，J=9.0 Hz，H-2′，6′)，7.30(1H，d，J=2.0 Hz，H-8)，7.22(1H，dd，J=9.5，2.0 Hz，H-6)，6.98(2H，d，J=9.0 Hz，H-3′，5′)，5.10(1H，d，J=4.5 Hz，glc-H-1)3.73(3H，s，4′-OCH3)。13C-NMR(DMSO-d6，125 MHz)δ：153.1(C-2)，124.0(C-3)，174.3(C-4)，126.5(C-5)，115.2(C-6)，161.9(C-7)，103.0(C-8)，157.4(C-9)，118.5(C-10)，123.0(C-1′)，129.7(C-2′)，113.2(C-3′)，159.4(C-4′)，113.2(C-5′)，129.7(C-6′)，101.0(glc-C-1)，73.9(glc-C-2)，77.8(glc-C-3)，70.6(glc-C-4)，77.0(glc-C-5)，61.7(glc-C-6)，54.0(4′-OCH3)。以上数据与文献[9]报道基本一致，故鉴定该化合物为芒柄花苷(Formononetin-7-O-β-D-glucopyranoside)。

化合物5：白色粉末(三氯甲烷)，mp 198～199 ℃，ESI-MSm/z: 425 [M+H]+，分子式C22H16O9(不饱和度Ω=15)。1H-NMR(CDCl3，500 MHz)δ：8.13(1H，s，H-2)，8.01(1H，d，J=9.5 Hz，H-5)，7.45(2H，d，J=10.5 Hz，H-2′，6′)，6.93(1H，dd，J=9.5 Hz，H-6)，6.85(2H，d，J=10.5 Hz，H-3′，5′)，6.73(1H，d，J=10.0 Hz，H-4″)，5.69(1H，d，J=10.0 Hz，H-3″)，1.42(6H，s，H-2″-CH3)。13C-NMR(CDCl3，125 MHz)δ：152.6(C-2)，125.6(C-3)，176.8(C-4)，127.3(C-5)，116.0(C-6)，158.4(C-7)，109.7(C-8)，153.2(C-9)，118.9(C-10)，123.0(C-1′)，130.9(C-2′)，115.7(C-3′)，156.5(C-4′)，115.7(C-5′)，130.9(C-6′)，78.5(C-2″)，131.0(C-3″)，115.8(C-4″)，28.6(C-2″-CH3)。以上数据与文献[10]报道基本一致，故鉴定该化合物为Isoerythrinin A。

化合物6：无色针晶(吡啶)，mp 298～299 ℃，ESI-MSm/z: 271 [M+H]+，分子式C15H10O5(不饱和度Ω=11)。1H-NMR(DMSO-d6，500 MHz)δ：12.89(1H，s，5-OH)，10.85(1H，s，7-OH)，9.53(1H，s，4′-OH)，8.25(1H，s，H-2)，7.38(2H，d，J=9.0 Hz，H-2′，6′)，6.88(2H，d，J=9.0 Hz，H-3′，5′)，6.33(1H，d，J=2.0 Hz，H-6)，6.15(1H，d，J=2.0 Hz，H-8)。13C-NMR(DMSO-d6，125 MHz)δ：153.5(C-2)，122.0(C-3)，180.0(C-4)，161.7(C-5)，99.5(C-6)，164.1(C-7)，93.4(C-8)，157.1(C-9)，104.4(C-10)，121.4(C-1′)，129.8(C-2′)，115.1(C-3′)，157.3(C-4′)，115.1(C-5′)，129.8(C-6′)。以上数据与文献[11]报道基本一致，故鉴定该化合物为染料木素(Genistein)。

化合物9：黄色粉末(吡啶)，mp 291～292 ℃，ESI-MSm/z: 331 [M+H]+，分子式C17H14O7(不饱和度Ω=11)。1H-NMR(DMSO-d6，500 MHz)δ: 7.43(2H，s，H-2′，6′)， 7.01(1H，s，H-3)， 6.89(1H，d，J=2.0 Hz，H-8)，6.76(1H，d，J=2.0 Hz，H-6)，3.88(6H，s，OCH3)。13C-NMR(DMSO-d6，125 MHz)δ: 164.5(C-2)，104.3(C-3)，182.5(C-4)，162.9(C-5)，99.8(C-6)，165.6(C-7)，94.8(C-8)，158.4(C-9)，104.8(C-10)，121.2(C-1′)，105.2(C-2′,6′)，149.1(C-3′，5′)，141.9(C-4′)，56.4(3′，5′-OCH3)。以上数据与文献[14]报道基本一致，故鉴定化合物为苜蓿素(Tricin)。

化合物10：白色针晶(吡啶)，mp 206～207 ℃，ESI-MSm/z: 257 [M+H]+，分子式C15H12O4(不饱和度Ω=9)。1H-NMR(DMSO-d6，500 MHz)δ：7.70(1H，d，J=9.0 Hz，H-5)，7.48(2H，d，J=9.0 Hz，H-2′，6′)，6.81(2H，d，J=9.0 Hz，H-3′，5′)，6.55(1H，d，J=9.0，2.0 Hz，H-6)，6.41(1H，d，J=2.0 Hz，H-8)，5.50(1H，dd，J=13.0，2.5 Hz，H-2)，3.16(1H，dd，J=16.5，13.0 Hz，H-3α)，2.65(1H，dd，J=16.5，2.5 Hz，H-3β)。13C-NMR(DMSO-d6，125 MHz)δ：79.1(C-2)，43.3(C-3)，190.2(C-4)，128.5(C-5)，110.3(C-6)，165.0(C-7)，102.8(C-8)，163.3(C-9)，113.8(C-10)，129.2(C-1′)，128.5(C-2′,6′)，115.1(C-3′，5′)，158.1(C-4′)。以上数据与文献[15]报道基本一致，故鉴定化合物为甘草素(Liquiritigenin)。

4 抗氧化活性的测定

采用DPPH法对化合物1～10进行抗氧化活性测定[16]：向96孔板中加入新鲜配制的0.18 mmo1/L DPPH乙醇溶液和以无水乙醇配制的不同浓度梯度的受试液各100 μL，混匀，室温下避光静置30 min，测定在517 nm波长下的吸光度(A1)；以无水乙醇为参比溶液，以无水乙醇等量替换受试液为空白对照，测定吸光度(A0)；以样品溶液与无水乙醇各100 μL的混合溶液为样品对照，测定吸光度(A2)，用来消除样品本身颜色所产生的误差；以维生素C作为阳性对照，平行3次，分别计算清除率。结果见表1。可见，化合物1～8均有较强的清除DPPH自由基的能力，化合物9和化合物10都不具有清除DPPH自由基的能力；组间统计分析可见：化合物2具有较强的抗氧化能力，但弱于维生素C，化合物3和化合物6比较差异无统计学意义，化合物4、化合物7和化合物8相比也无统计学意义。

表1 化合物1～10清除DPPH自由基的IC50值