经SDF-1转染的间充质干细胞对高糖所致足细胞损伤的修复作用

郑帅 杨敏 王家平 杨扬 白彝华

(昆明医科大学第二附属医院 1肾脏内科,云南 昆明 650101;2放射科)

糖尿病肾病(DKD)是糖尿病主要的微血管并发症之一〔1〕，其病变主要累及肾脏小血管和肾小球，引起蛋白尿排泄和滤过异常，已成为终末期肾病(ESRD)的主要发病原因〔2〕。目前，针对DKD的治疗手段及疗效均有限，因此对于DKD的治疗已经成为全世界的难题。间充质干细胞(MSCs)来源于中胚层，是一种具有自我复制更新能力及多向分化潜能的多能干细胞。同时，MSCs体外培养条件不高，可不断传代，具有抗氧化应激、抗纤维化和调节免疫应答等多效性，使干细胞移植成为治疗糖尿病及其并发症的研究方向，尤其是治疗多诱因导致的DKD的研究热点〔3〕。研究表明〔4〕，MSCs静脉给药后1型糖尿病小鼠不仅改善了血糖水平，而且表现出更好的肾脏组织学特征，并抑制炎症因子的表达和DKD纤维化。提示MSCs是治疗DKD的一种可行的手段。基质细胞衍生因子(SDF)-1，又名CXCL12，是骨髓基质细胞产生的一种趋化蛋白〔5〕。在各个组织中，SDF-1呈现不同的作用，在慢性肾损伤中，损伤肾组织局部高表达SDF-1能够诱导MSCs沿浓度梯度迁移至损伤部位并实现归巢，从而修复损伤部位。在肾损伤的微环境中，经SDF-1转染能否利于MSCs迁移到损伤部位并对损伤部位起修复作用，尚不可知。本研究拟探索SDF-1转染对MSCs的影响。

1 材料和方法

1.1材料 小鼠足细胞MPC5购自广州吉妮欧生物科技有限公司，DMEM培养基购自Gibco公司，SDF-1α腺病毒购自上海吉凯基因公司，聚合酶链反应(PCR)试剂盒及Western印迹试剂盒购自武汉华美生物公司。提取骨髓MSC的C57BL/6小鼠购自扬州大学比较医学中心〔SCXK(苏)2012-0004〕。

1.2分组 首先通过高糖培养小鼠足细胞系MPC5来构建足细胞受损模型。构建模型成功后将细胞分为3组，空白对照组：高糖(30 mmol/L)诱导凋亡损伤的肾小球足细胞培养组；MSC组：MSCs与高糖诱导凋亡肾小球足细胞联合培养组；MSC-SDF-1组：经SDF-1转染的MSCs与高糖诱导凋亡的肾小球足细胞联合培养组。

1.3MSC的分离及培养 取小鼠脐带组织，用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3遍，用眼科剪将组织标本剪碎；将脐带转移至细胞分离管中，加入培养基后，组织分离器搅拌3次，45 s/次。 然后将组织转移至50 ml离心管中加入适量PBS，1 000 r/min离心15 min，弃上清，再加入PBS重复洗涤 3次，加培养液，置于37℃、5%CO2培养箱培养。待细胞融合度达到80%以上，收集细胞并传代，传至第3代时，进行后续试验。

1.4SDF-1的细胞转染 将P3代MSC以2×105密度接种于6孔板，MSC组加入完全培养基；MSC-SDF-1组以感染复数为40的SDF-1α腺病毒溶于无血清培养基感染MSC，转染6 h后弃去含有腺病毒的无血清培养基，新加完全培养基。于37℃、5% CO2、20% O2培养箱中培养48 h。倒置荧光显微镜下观察腺病毒转染效果，并采用Western印迹法检测SDF-1表达。

1.5Transwell细胞迁移实验 选取8 μm孔径滤膜的Transwell细胞板，每组分别取0.2 ml细胞悬液加入Transwell细胞板的上室。下室中加入500 μl 100 μg/L的SDF-1α蛋白无血清培养基，于37℃、5% CO2、20%O2培养箱中培养12 h。取出上室，棉签擦拭滤膜上部未穿膜迁移细胞后PBS洗涤。多聚甲醛固定穿膜细胞20 min后结晶紫染色，10 min后洗去，用棉签擦去小室上层未迁移的细胞，各取6个视野显微镜下观察拍照，计算并求平均值。观察并拍照后分别用0.4 ml 33%冰醋酸溶解已染色细胞内的结晶紫，用酶标仪于565 nm波长下检测各组光密度。

1.6Western印迹检测 移除培养基，PBS洗涤后收集细胞，加入蛋白裂解液，0℃裂解30 min，12 000 r/min离心15 min后，取上清，二喹啉甲酸(BCA)法检测蛋白浓度。上清加入蛋白上样缓冲液于100℃变性5 min。配置10%分离胶及浓缩胶，每孔加入30 μg蛋白样本进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。200 mA恒流电转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。脱脂奶粉配置5%封闭液，封闭60 min，以β-actin蛋白为内参，分别加入β-actin、SDF-1、半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶(casepase)-3抗体，4℃封闭过夜。洗膜后加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的相应二抗，室温孵育60 min。洗膜，电化学发光(ECL)试剂盒反应后拍照。样本灰度值的相对表达量采用ImageJ软件进行分析。

1.7细胞中总RNA提取 收集共培养48 h后的MPC-5细胞，加入1 ml RNAiso Plus溶液(Takara 9109)，室温孵育10 min，充分裂解细胞。收集细胞裂解液入1.5 ml离心管中，加入200 μl氯仿，振荡，室温静置5 min。13 000 r/min，4℃离心15 min。吸取离心好的上清，并转移至新的离心管中，加入等体积异丙醇500 μl。充分混匀，冰上放置30 min。13 000 r/min，4℃离心10 min。小心弃上清，可见管底有白色沉淀。加入1 ml预冷的75%乙醇。7 500 r/min，4℃离心5 min。弃上清，倒立离心管于吸水纸上，超净工作台中晾干后，加入20 μl焦碳酸二乙酯水溶解沉淀，即为总RNA样品。

1.8RNA逆转录 冰上配置如下体系：5×gDNA Eraser缓冲液2.0 μl，gDNA Eraser 1.0 μl，Total RNA 1～7 μl，RNase Free dH2O至10 μl。将如上反应体系于42℃处理2 min，保存于4℃。向反应体系中加入如下试剂：Reaction solution from step 1 10.0 μl,5×PrimeScript缓冲液(用于实时定量PCR) 4.0 μl,PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅰ 1.0 μl,RT Primer Mix 1.0 μl,RNase Free dH2O至20 μl。将反应体系于37℃处理15 min，然后85℃处理5 s，然后保存于4℃。

1.9实时定量PCR检测各基因的表达 GAPDH引物：正义：5′-TGGAATCCACTGGCGTCT-3′,反义：5′-GGTTCACGCCCATCACAAAC-3′,胰岛素样生长因子(IGF)-1 引物：正义：5′-CGAGGGGCTTTTACTTCAAC-3′,反义：5′-GGCTGCTTTTGTAGGCTTC-3′；转化生长因子(TGF)-β引物：正义：5′-CGAAGCGGACTACTATGCTA-3′,反义：5′-GAATGTCTGACGTATTGAAGAA-3′。采用如下反应体系：SYBR Premix Ex Taq 10 μl，Primer Mix 1 μl(各10 μmol/L),ROX reference dyeⅡ 0.4 μl,cDNA 2 μl,Sterilized H2O至20 μl。PCR条件：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 34 s，40个循环，进行实时PCR检测。

1.10统计学分析 采用SPSS21.0软件进行单因素方差分析、独立样本t检验。

2 结 果

2.1细胞损伤模型建立 经过高糖诱导后，caspase-3蛋白酶表达增加，见图1。说明细胞损伤模型建立成功。

2.2MSCs的转染 MSC-SDF-1组经转染的MSCs中过表达SDF-1，并且表达效率高，见图2。说明SDF-1转染MSCs成功。

2.3各组穿过Transwell膜的细胞数 MPC-5组穿过Transwell膜的细胞数为0，MSC+MPC-5组迁移细胞数为(93±14)个，MSC+SDF-1+MPC-5组迁移细胞数为(182±24)个，各组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。见图3。

图1 高糖诱导前后caspase-3蛋白酶的表达

图2 各组细胞培养中SDF-1表达

图3 各组细胞迁移情况及细胞迁移数量(结晶紫染色，×200)

2.4各组IGF-1、TGF-β的表达 与空白对照组(均为1.00±0.00)比较，MSC组IGF-1(0.25±0.13)和TGF-β含量(0.24±0.08)显著降低(P<0.05)，而MSC+SDF-1组较MSC组IGF-1(0.04±0.03)和TGF-β含量(0.07±0.06)显著降低(均P<0.05)。

2.5各组caspase-3表达 MSC组、MSC-SDF-1组caspase-3含量(0.50±0.06，0.20±0.04)显著低于空白对照组(1.20±0.11，均P<0.05);而MSC+SDF-1组中caspase-3的含量较MSC组明显下降(P<0.05)，见图4。

图4 各组caspase-3蛋白酶表达

3 讨 论

DKD是导致ESRD的重要原因〔6〕。在复杂的生理病理过程中，肾脏的足细胞受损在DKD中发挥重要的作用。因此，若能修复受损足细胞，则减轻了大量蛋白尿的产生，延缓DKD患者肾功能恶化的进展。高糖培养MPC-5细胞是经典的体外DKD模型，是研究DKD诱导足细胞损伤的理想方法。

MSCs是在骨髓基质中分离的非造血细胞，由Friendstein等〔7〕在1967成功分离并培养。它在一定条件下可以自我更新并分化为多种功能性细胞。相关研究提示，MSCs的作用主要是通过抗凋亡、抗炎因子、细胞保护作用及细胞分化介导的〔8,9〕。当一定数量的MSCs注入后，便会种植在受损的细胞表面，并且这些细胞能够通过分泌细胞因子和体液因素〔如血管内皮细胞生长因子(VEGF)、IGF〕，创造一个适宜的微环境。已证实MSCs对受损肾小管细胞及血管内皮细胞均有修复作用〔10，11〕。这支持了MSCs有可能参与肾脏组织的修复和再生。但目前应用MSCs移植后归巢数量不足。而SDF-1与MSCs的定向迁移和成血管能力密切相关。SDF-1是趋化因子中的一种小型分泌蛋白，与相关受体结合后可参与干细胞归巢、组织修复、免疫调节等众多机体活动中，并发挥重要作用。本实验结果提示SDF-1转染使MSCs更容易迁移至受损足细胞侧。可能与SDF-1可通过趋化、黏附、捕获等方式促进MSCs迁移至受损的足细胞侧有关〔12〕。推测通过转染SDF-1，使得MSCs迁移至损伤足细胞侧并起到修复作用成为可能。

本实验发现，与MSCs共培养能够抑制IGF-1和TGF-β的表达。现代医学认为，DKD的主要影响因素有糖代谢紊乱、氧化应激、炎症反应及内质网应激等。相关研究表明〔13,14〕，MSCs干预后可改善肾小球纤维化的病理异常。IGF主要通过自分泌和旁分泌对细胞组织的增殖、分化、凋亡和机体的生长发育起着重要的调节作用，是体内一类具有多功能的细胞增殖调控因子。IGF主要通过特殊的IGF-1受体来完成代谢，IGF-1通过激活细胞信号传导通路来激活基因的表达。胰岛素水平等因素影响着IGF-1的合成，IGF-1广泛存在于肾脏中〔15〕。在DKD中，高血糖致肾小球系膜细胞缺氧损伤，导致肾脏局部IGF-1旁分泌合成代偿增高，同时降解减少，最终导致IGF-1增高，与此同时，IGF-1使细胞外基质成分堆积加速肾小球硬化〔16〕。Bach等〔17〕发现在链脲佐菌素(STZ)诱发的DKD大鼠肾脏内IGF-1的增加，提示IGF是引起DKD高滤过的主要原因之一。TGF-β被认为是肾小管间质纤维化形成与发展的关键因子，在肾脏纤维化的发病机制中起着重要的调控作用〔18〕，并能在刺激上皮间充质转化(EMT)生成的同时又抑制其降解，促进肾纤维化形成〔19〕，因此TGF-β是诱导DKD肾脏纤维化的重要介质。而TGF-β有多种亚型，其中TGF-β1又与纤维化的发生、发展关系最为密切。TGF-β糖尿病大鼠中TGF-β1的表达显著升高，MSCs治疗DKD过程中TGF-β1的表达下降，并提高了紧密结合蛋白的表达，从而抑制上皮细胞-间充质细胞的转换，遏制蛋白尿和纤维化的继续恶化〔4〕。本实验说明经SDF-1转染能提高MSCs修复足细胞损伤的能力。此外，本研究通过MSCs治疗后可使caspase-3蛋白酶含量明显减少，已知细胞凋亡是通过caspase-3蛋白酶诱导产生的〔20〕，表明MSCs能够延缓足细胞的凋亡，并且通过SDF-1转染后MSCs这种抑制足细胞凋亡的作用更加明显，与文献报道经MSCs治疗后可显著抑制caspase-3激活，减少细胞死亡的结论一致〔21〕。

综上，在体外实验中，证实了MSCs能够下调足细胞中IGF-1和TGF-β的表达。通过SDF-1转染的MSCs不仅能够更高效地迁移至受损足细胞侧，且对损伤足细胞起到更显著的修复作用。