壮药龙钻通痹方影响类风湿关节炎大鼠成骨细胞转录因子Smad5的时序性分析

田照 庞宇舟 袁德培 方刚 张曼 王文晟 余远鹏

(1湖北民族大学医学院，湖北 恩施 445000；2广西中医药大学壮医药学院)

类风湿关节炎(RA)是一种好发于中年肥胖女性及老年群体的自身免疫性疾病，以小关节对称性炎症和骨质进行性破坏为主要特征〔1〕。在北欧及北美地区RA患病率为0.5%～1.0%，中国地区约为0.42%，随着人口老龄化加剧及死亡率下降，预计本病的患病率将会继续提高〔2,3〕。现代医学治疗RA以改善病情的抗风湿病药(DMARDs)为主，联合皮质类固醇、生物制剂或化学合成剂等〔4〕。上述方法通常可取得较好的疗效，能够延缓病情进展，但治疗期间的一些副作用如肝损害、骨髓抑制等也不容忽视。故探索疗效可靠且副作用小的替代药物或辅助疗法一直是当今医学界努力的方向。

龙钻通痹方由飞龙掌血、大钻、两面针、五指毛桃根、八角枫、鸡血藤、青风藤、九龙藤八味壮药构成。前期研究证实本方可降低患者红细胞沉降率，改善关节疼痛麻木，缩短晨僵时间，有助于延缓病情，降低致残率〔5〕。其作用机制可能与调控Toll样受体(TLR)4/核因子(NF)-κB信号通路，降低白介素(IL)-6等炎症因子及TLR4、髓样分化因子(MYD)88基因表达有关〔6〕。同时，研究显示龙钻通痹方干预胶原诱导性关节炎(CIA)模型大鼠可减少滑膜组织炎症细胞浸润，下调大鼠血清和滑膜匀浆液中死亡受体Fas表达，同时提高死亡受体配体FasL的表达水平。故推测龙钻通痹方治疗RA可能也与调控Fas/FasL系统有关〔7〕。

RA的致畸致残与骨内稳态失衡有密切关系，骨基质不断被破骨细胞吸收，随后由成骨细胞替代形成新骨，由此形成骨重建进而达到骨内稳态平衡〔8,9〕。成骨细胞是维持骨骼结构和调节骨微环境稳态的关键，已有研究证实，Smad5是成骨细胞分化调控通路骨形态发生蛋白(BMP)/Smads的重要调节因子之一，在促进骨祖细胞向成骨细胞分化及维持骨稳态方面起着非常关键的作用〔10,11〕。在关节炎条件下，Smad5表达降低，成骨细胞分化信号亦随之减弱，致使骨矿化失常、骨质丢失、关节软骨和软骨下骨逐渐遭受破坏〔12〕。故促进成骨细胞分化、增加骨细胞基数，对维持骨的正常结构及最终防止RA致残具有重大意义。本研究拟探讨龙钻通痹方对成骨细胞分化转录因子Smad5的影响及时序性关系。

1 材料与方法

1.1实验材料 雄性SPF级SD大鼠96只，体重180～220 g(湖南斯莱克景达，SCXK(湘)2016-002)。龙钻通痹方(颗粒剂)，批号20180508。

大鼠Smad5酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(武汉华美生物工程)；Smad5抗体、弗氏完全佐剂(美国Sigma)；三氯甲烷、异丙醇(成都科隆)等。

智能热板仪(成都盟泰，RB-200)；全自动实时荧光定量PCR仪(瑞士罗氏，Light Cycler96)；多功能酶标仪(瑞士TEACAN ，M200)；高速冷冻离心机(Sigma，3K15)；研究型倒置显微镜(德国莱卡，DM18)等。

1.2模型制备 将96只SD大鼠适应性喂养1 w后随机分为正常组、模型组、西药组、壮药组，每组24只，每组分为四个亚组，分别是7、14、21、28 d亚组。除正常组外，参照文献〔13〕中所述方法制备佐剂性RA大鼠模型，即在大鼠右后足底注射弗氏完全佐剂0.15 ml，1 w后在其尾根部再次注射0.1 ml。壮药组灌胃龙钻通痹颗粒溶液〔0.54 g/(100 g·d)〕，西药组灌胃甲氨蝶呤(2.7 mg/kg)，正常组、模型组分别灌胃等体积蒸馏水，灌胃总时间为21 d，分别在第7、14、21天进行前3次取材，停药1 w后，第4次取材。所取组织为全血、膝关节软骨及右后踝关节以下骨组织。造模期间无动物死亡，全部纳入数据分析。

1.3观察指标

1.3.1RA模型大鼠形态指标观察

1.3.1.1RA大鼠足底热板痛阈值检测 每只大鼠测试前在热板仪中适应性活动5 min，然后打开热板仪，恒温50℃，记录大鼠第一次舔后足的热痛时间，每只大鼠检测3次，取平均值。

1.3.1.2RA大鼠关节肿胀度检测 以游标卡尺测大鼠造模前后右后足的肿胀度，造模前1 d测量1次；造模后给药第7、14、21天，停药1 w后的第28天分别测量1次。公式：肿胀度=(注射后足跖厚度-注射前足跖厚度)/注射前足跖厚度。

1.3.2实时荧光定量(RT)-PCR检测RA大鼠膝关节软骨Smad5 mRNA表达 液氮研磨关节软骨，提取总RNA，测定总RNA浓度，按逆转录试剂盒合成cDNA，反应条件为42℃15 min，95℃3 min。Smad5(目的基因)引物委托上海生工生物工程有限公司合成，上游引物：5'-TACCTCCAGTGTTAGTGCCTCGTC-3'，下游引物：5'-GTGCGGCTCATTGTGGCTCAT-3'；内参GAPDH上游引物：5'-GACATGCCGCCTGGAGAAAC-3'，下游引物：5'-AGCCCAGGATGCCCTTTAGT-3'。按扩增试剂盒配制扩增体系(20 μl)，采用两步法扩增，总共40个循环。

1.3.3Western印迹检测RA大鼠关节软骨Smad5蛋白表达 从-80℃冰箱取出关节软骨，液氮中研磨提取蛋白，测蛋白浓度，制备8%的分离胶及5%的浓缩胶，80 V压缩浓缩胶，120 V电泳至条带到底，275 mA转模60 min，TBST洗膜3次，随后封闭60 min。 Smad5、内参GAPDH、一抗、二抗均按说明书进行稀释， 4℃孵育一抗过夜，第2天TBST洗膜后室温孵育二抗60 min，最后配A、B发光液显影。

1.3.4ELISA检测RA大鼠血清Smad5蛋白含量 从-80℃冰箱取出已分装好的血清，严格按照试剂盒步骤操作。

1.3.5大鼠踝关节形态学检测 常规石蜡包埋，切片，HE染色，光镜下观察踝关节软骨组织形态学病理改变。

1.4统计学方法 采用SPSS19.0软件,计量资料组间对比行单因素方差分析，两两组间比较采用t检验。

2 结 果

2.1龙钻通痹方对RA大鼠足底热板痛阈值的影响 与正常组比较，其余各组足底痛觉敏感，阈值时间短(P<0.05)；与模型组相比，壮药组与西药组在第7、14、21、28天痛阈值均明显高于模型组(P<0.05)，相比其他时间段，第21天时段与正常组略接近，但也有显著差异(P<0.05)，说明痛阈值与其给药时间有一定关连性。与西药组相比，壮药组未见显著性差异(P>0.05)。见表1。

表1 各组足底热板痛阈值比较

与正常组比较：1)P<0.05；与模型组比较：2)P<0.05；下表同

2.2龙钻通痹方对RA大鼠足跖关节肿胀度的影响 与正常组比较，其余各组关节肿胀明显(P<0.05)；与模型组比较，壮药组与西药组在给药14 d后肿胀度均明显下降，在21 d肿胀下降最明显(均P<0.05)；与西药组比较，壮药组未见显著性差异(P>0.05)。见表2。

2.3龙钻通痹方对RA大鼠关节软骨Smad5 mRNA表达的影响 与正常组比较，除21 d时段壮药组与西药组Smad5 mRNA表达接近于正常组(P>0.05)。以外，其余各组各时段Smad5 mRNA表达明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)；第14～28天，壮药组、西药组Samd 5 mRNA表达明显高于模型组(P<0.05)，壮药组与西药组间比较无显著差异(P>0.05)。见表3。

2.4龙钻通痹方对RA大鼠关节软骨Smad5蛋白表达的影响 与正常组比较，模型组各时间段Smad5蛋白表达均明显降低(P<0.05)；壮药组与西药组在21 d时段Smad5蛋白表达最高，但仍明显低于正常组(P<0.05)；与模型组比较，壮药组、西药组第14天开始明显上调(P<0.05)。壮药组与西药组无显著差异(P>0.05)。见图1，表4。

表2 各组足跖肿胀度检测

表3 各组关节软骨Smad5 mRNA时序性比较

图1 各组大鼠Smad5蛋白的组间及时序性表达

组别7 d14 d21 d28 d壮药组0.56±0.051)0.75±0.101)2)0.93±0.031)2)0.77±0.081)2)西药组0.51±0.031)0.86±0.081)2)0.98±0.081)2)0.80±0.061)2) 模型组0.42±0.081)0.44±0.071)0.43±0.051)0.46±0.071) 正常组1.13±0.131.17±0.201.05±0.191.14±0.15

2.5龙钻通痹方对RA大鼠血清Smad5蛋白含量的影响 与正常组比较，其余各组各时间段Smad5蛋白含量均明显下调(P<0.05)，21 d时段壮药组与西药组Smad5蛋白含量略接近于正常组，但差异仍有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，壮药组与西药组在给药21 d开始Smad5蛋白含量明显上调(P<0.05)。见表5。

2.6龙钻通痹方对RA大鼠病理学形态变化的影响 正常组大鼠踝关节滑膜光滑无增生，层次清晰，软骨细胞分布规律，未见炎症浸润(图2A)。与正常组比较，模型组滑膜表面增生明显，关节腔变窄(图2B)，见炎性渗出伴大量淋巴细胞分布(图2C)，图2C为图2B黑色星号处高倍镜下展示。与模型组比较，壮药组灌胃7 d后仍可见大量炎症细胞，软骨细胞分布较少(图2D)；14 d后可见炎性浸润减少，滑膜表面较光滑(图2E)；21 d后软骨细胞排列整齐，淋巴细胞减少(图2F)。西药组给药7 d后关节滑膜仍可见大量炎性渗出和淋巴细胞，关节腔狭窄，滑膜层次不清晰(图2G)；14 d后见炎症细胞减少，软骨细胞增多，排列较整齐(图2H)；给药21 d后关节腔清晰，炎性渗出不明显，滑膜层次减少，表面光滑(图2I)。

表5 各组血清Smad5蛋白时序性比较

图2 各组大鼠踝关节HE染色比较(×100)

3 讨 论

RA是以滑膜异常增殖，血管翳形成，软骨破坏及钙流失为其主要病理改变的全身性炎症性疾病〔14〕。随着病情加剧，患者小关节易致畸致残，丧失劳动力，严重影响患者心理健康及生活质量，加重经济成本和社会负担〔15〕。所以，如何防治RA，延缓病程及防止致畸致残已是世界级医学难题。由于RA的软骨破坏与成骨细胞分化程度密切相关，故探索与成骨细胞分化的通路调控因子也是当今研究的热点话题。

越来越多的传统中药已被发现对下调骨吸收促进因子及上调骨保护因子进而维持破骨-成骨平衡具有重要作用，民族医药中的壮医热敏探穴针刺疗法，藏医内服外浴结合法等在治疗RA的过程中都取得了较好的疗效〔16～19〕。故在传统医学领域积极寻找较好的RA治疗方法前景广阔。已有研究显示，Smad5是成骨细胞分化BMP/Smad通路中不可缺失的一环，Smad5表达升高可提高骨祖细胞向成骨细胞分化的转化率，有利于新骨的形成〔20〕。龙钻通痹方主药为飞龙掌血和大钻，飞龙掌血主要化学成分为生物碱、香豆素、黄酮等，用其提取物干预RA小鼠模型，可减轻爪和关节肿胀度，使关节骨和软骨遭受破坏的程度明显低于对照组〔21,22〕；大钻具有抗炎、抗氧化、提高免疫力等作用，对风湿性疾病引发的痛症效果显著〔23〕。

本研究西药组Smad5 mRNA及蛋白表达略高于壮药组，可能与RA的顽固性有关。在没有西药干预的条件下，传统方式需要多途径多疗法予以治疗；而西药对比传统药物来说起效时间相对较快。本研究认为龙钻通痹方干预佐剂性RA模型大鼠的起效时间可能从1 w后开始，在14～21 d时间段达到效应峰值。由于未在RA患者群中做时序性研究，后期将结合临床予以完善，为RA防治策略提供理论支撑。