miR-424在乳腺癌中的表达及与临床病理特征之间的关系

李自涛 马志军 刘震 沈国双

(青海大学附属医院肿瘤外科二，青海 西宁 810001)

虽然，乳腺癌患者经过手术、化疗、放疗及内分泌治疗，总体的5年生存率有了明显提高，但是每年的死亡人数仍然很庞大，给广大女性的健康造成严重威胁，仍需要寻找新的治疗的手段，探索新的治疗靶点〔1〕。miRNAs是一类18～22个核苷酸的小非编码RNAs片段，在疾病的发生中起重要作用，与细胞的增殖、凋亡和分化等密切有关〔2〕。miR-424属于miR-16家族〔3，4〕，是一个由22个碱基组成的小核酸分子，可能位于X性染色体上。miR-424在很多肿瘤中都有研究〔3～14〕，包括非小细胞肺癌、胃癌、结直肠癌、胰腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、食管癌、骨肉瘤、肝癌等。但是，在乳腺癌中研究的相关报道较少〔4〕。本研究拟通过分析85例乳腺癌患者miR-424的表达水平，观察miR-424在癌组织中的表达情况，并分析其与乳腺癌患者临床病理学特征的关系。

1 材料与方法

1.1临床资料 收集2016～2017年青海大学附属医院肿瘤外科行手术治疗的85例早期乳腺癌患者癌组织及癌旁组织(距离癌组织大于5 cm)新鲜手术标本，癌旁组织作为阴性对照。全部为女性，主要长期居住地在西宁市(44例，51.76%)，湟中县(8例，9.41%)，乐都县(8例，9.41%)，大通县(6例，7.06%)，这几个地区平均海拔约为2 200 m，属于高海拔地区。居住在其他地区19例。年龄29～73岁，平均年龄(50.85±8.93)岁。其中汉族68例(80.00%)，回族8例(9.41%)，藏族6例(7.06%)，蒙古族1例(1.18%)和土族2例(2.35%)。有肿瘤家族史患者2例(2.35%)，1例为母亲患有乳腺癌，另外1例为父亲结肠癌患者，其余患者否认肿瘤家族史。收集的新鲜组织迅速转移至-80℃的超低温冰箱保存，中途时间小于30 min，所有标本收集完成后，统一在青海大学附属医院中心实验室进行后续处理和RT-qPCR操作。标本的收集工作均经患者和患者家属知情同意，并通过青海大学附属医院伦理委员会批准通过。

1.2纳入及排除标准 纳入标准：①经病理证实为早期浸润性乳腺癌；②术前未行化疗、放疗和内分泌治疗；③年龄18～70周岁。排除标准：①发病前己有远处转移病灶；②合并其他恶性肿瘤患者；③患者术前有器官移植病史或其他影响重要器官功能的重大疾病史；④拒绝签收知情同意书的患者。

1.3主要试剂及设备 实验miR-424与U6引物序列由北京天根生化科技有限公司设计合成，miRcute miRNA提取分离试剂盒、miRcute增强型miRNA cDNA第一链合成试剂盒和miRcute增强型miRNA荧光定量检测试剂盒，北京天根生化科技有限公司。引物序列：miR-424-5p上游引物5′-CTCGAGAACTCGAGTCACCCACTACGTTGTTCCAAG-3′，下游引物5′-GAATTCAAGAATTCGGTGGTATTCTGATTGGGAAGG-3′；U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。7500 Fast实时荧光定量PCR仪，美国ABI公司，核酸蛋白检测仪，美国Thermo公司。

1.4实验方法 采用离心柱法提取组织总RNA，经超微量核酸分析仪鉴定，OD260/OD280为1.8～2.0，说明提取的总RNA浓度和纯度合格，可用于后续实验。PCR反应体系共20 μl：2×miRcute增强型miRNA定量预混试剂盒(SYBR&ROX) 10 μl，正向引物1 μl，反向引物0.4 μl，miRNA第一链 cDNA 2 μl，无RNA酶双蒸水6.6 μl；反应条件：95℃预变性15 min，94℃变性20 s，60℃退火、延伸34 s，一共进行40次循环。以U6为内参，采用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。实验重复3次，取平均值。

1.5统计分析 采用SPSS19.0软件行方差分析、t检验。

2 结 果

2.1miRNA-424在乳腺癌组织中表达呈低表达 乳腺癌组织中miRNA-424的相对表达量为(0.38±0.10)，癌旁组织miR-424的相对表达量为(1.32±0.16)，miR-424在乳腺癌组织中的表达量明显低于癌旁组织，差异具有统计学意义(P<0.001)。

2.2miR-424与乳腺癌患者临床病理特征关系 在癌组织中miR-424的相对表达量与患者年龄、民族、月经史、孕次、产次、家族史、肿瘤部位、肿瘤直径、病理阳性淋巴结数、病理TNM分期、肿瘤病理学类型、淋巴细胞浸润、脉管瘤栓、神经侵犯、人类表皮生长因子受体(HER)-2状态、P53、膜蛋白质P120和上皮型钙黏附分子(E-CA)没有相关性(P>0.05)；而与患者肿瘤的组织分化程度、雌激素受体(ER)状态、孕激素受体(PR)状态、增殖细胞相关核抗原(Ki-67)、CK5/6、分子分型和表皮生长因子受体(EGFR)状态相关，有统计学意义(P<0.05)。见表1～3。

表1 miRNA-424与乳腺癌患者人口统计学之间的相关性

表2 miRNA-424与乳腺癌患者肿瘤学之间的相关性

表3 85例乳腺癌患者病理特征之间的相关性

3 讨 论

miR-424(啮齿动物同源物miR-322)和miR-503是哺乳动物miR-15/107家族的成员，它们被H19X基因簇编码，位于人类染色体Xq26.3，miR-15/107家族的共享“种子”序列为“AGCAGC”，miR-424的表达比其他miR-15/107家族成员更具动态性和组织限制性，miR-15/107家族仅表达于脊索动物，其中miR-195、miR-497、miR-503、miR-424和miR-646具有哺乳动物特异性〔3〕。miR-424参与多种的肿瘤发生和进展，主要通过调节细胞周期、上皮-间质转化、低氧、组织分化和重塑〔3，4〕。

本研究结果显示miR-424可能是一个抑癌基因，在癌组织中低表达，其表达量与患者肿瘤的分化程度、ER状态、PR状态、Ki-67、分子分型、CK5/6和EGFR状态相关。当miR-424低表达时，分化程度也低，ER和PR状态也表达更低，而Ki-67表达水平更高，分子分型较差，预示着恶性程度增加。Wang等〔5〕分析了84例基底样乳腺癌患者临床病理特征与miR-424-5p相对表达量的关系，得出miR-424-5p与基底样乳腺癌的分期、肿瘤大小、阳性淋巴结数目、远处转移和家族史有关。同样也得出了，其在癌组织中呈低表达，差异具有统计学意义(P<0.001)。最后，miR-424-5p的低表达与基底样乳腺癌患者的临床分期晚、肿瘤大、转移淋巴结多、存在远处转移和组织学分级较差相关，其研究结果与我们的研究结果一致。Rodriguez-Barrueco等〔6〕同样报道了，miR-424(322)/503簇在乳腺癌中是低表达的，敲除该基因后可以增加乳腺癌化疗的耐药性。

在其他肿瘤中，miR-424也发挥着重要的作用。Xu等〔7〕发现宫颈癌与正常组织比较miR-424下调，通过定量RT-PCR检测147个宫颈癌组织与74个宫颈正常组织，发现miR-424在癌组织中的表达显著降低。同样发现miR-424的低水平表达与肿瘤分化差、临床分期晚、淋巴结转移多及其他不良预后临床病理参数呈正相关。Zhou等〔8〕发现宫颈癌组织和细胞中miR424-5p的表达显著降低。Xu等〔9〕发现miR-424(322)通过阻断细胞程式死亡-配体(PD-L)1免疫检查点激活T细胞免疫应答逆转化疗耐药性。癌组织中高水平的miR-424(322)与卵巢癌患者的无进展生存期呈正相关。Liu等〔10〕研究发现miR-424-5p在上皮性卵巢癌(EOC)组织和细胞系中明显低表达。miR-424-5p水平与EOC肿瘤大小、TNM分期、病理分级和淋巴转移呈负相关。Quan等〔11〕研究发现，miR-424在子宫内膜癌细胞中通过靶向E2F7抑制肿瘤。证明了miR-424在人子宫内膜癌中下调，并且抑制人类Ishikawa和HEC-1B子宫内膜癌细胞系的生长。Wen等〔12〕发现在ESCC组织和细胞系中miR-424-5p的表达水平均降低。此外，miR-424-5p的表达水平与食管鳞状细胞癌(ESCC)组织中的淋巴结转移数呈负相关。Peng等〔13〕发现在舌鳞状细胞癌附近组织中miR-424表达下调，miR-424的水平在舌鳞状细胞癌中上调。有趣的是，与正常舌组织相比miR-424在癌旁组织中表达下调，表明miR-424可能是该肿瘤减退的标志。Zhang等〔14〕发现miR-424-3p的下调与非小细胞肺癌(NSCLC)进展和总体预后相关，并且miR-424-3p和-5p都能阻碍NSCLC细胞的增殖、迁移和侵袭。综上，可以推测miR-424在不同的恶性肿瘤扮演着不同的作用，但在宫颈癌、卵巢癌、子宫内膜癌、NSCLC、舌鳞癌及食管癌中表达均降低，并且与肿瘤的恶性程度都有一定关系，与本研究结果相类似。

综上所述，miR-424可能是一个抑癌基因，在癌组织中低表达。其表达量与患者肿瘤的分化程度、ER状态、PR状态、Ki-67、分子分型和EGFR状态相关。结合目前相关文献，miR-424在其他肿瘤的研究结果与本研究结果相类似，都是低表达，并且与患者的临床病理特征相关。但是，还需要进一步研究其可能的作用机制及相关作用靶点，更加清晰地认识miR-424在乳腺癌中的重要作用。