食品包装用纸上环状芽孢杆菌的筛出

陈碧霄、周 帆、杨 淼、朱 南、纪晗旭、张 露、乔 玲、杨 洋、祝晨辰、刘艳容、杨婷婷、杜亚琼、冯诗旸、张驰

通讯作者： 张驰

南京市产品质量监督检验院 210019

国家质量监督检验检疫总局科技计划项目2017QK038 南京市质量技术监督局科技项目KJ2017005

食品包装纸是以纸浆及纸板为主要原料的包装制品，需要满足无毒，抗油、防水防潮，密封等要求，且符合食品包装安全要求的用于包装食品的纸。食品包装纸因其与食品直接接触，且其包装物大部分都是直接入口的食品，所以食品包装纸最基本的要求是必须符合食品卫生的要求，其次根据食品包装纸使用要求的不同,还必须达到相关的技术标准。

我国对于食品包装用纸的卫生要求，在GB11680-1989食品包装用原纸卫生标准中规定了食品包装用纸卫生指标重金属、微生物大肠菌群及致病菌的限量【1】，而在GB3561-1989食品包装用原纸卫生标准的分析方法中指出，食品包装用纸的风险监控致病菌包括沙门氏菌、志贺氏菌、葡萄球菌和溶血性链球菌【2】。

在对食品包装用纸的致病菌检测过程中，溶血性链球菌检测方法中使用了CNA哥伦比亚血琼脂平板，我们在检测过程中发现在血琼脂平板上出现具有溶血环，但菌落形态与溶血性链球菌菌落形态不同的菌落。因怀疑为致病菌，对其进行分离鉴定，分离出2种生物形态近似，且均能产生溶血环的菌株，定为X1和X2，并分别对X1和X2进行16S rRNA鉴定。

实验仪器和试剂

实验仪器

DNA电泳槽DYCP-31DN，北京六一仪器厂；稳压电泳仪DYY-5，北京六一仪器厂；电热恒温水槽 DK-8D，上海一恒科学仪器有限公司；凝胶成像仪 FR980，上海复日科技仪器有限公司；恒温培养箱 DHP-9162，太仓市科教器材厂；恒温摇床 TH2-C，太仓市实验设备厂；PCR 仪 Applied Biosystems2720， thermal cycler；冷冻高速离心机HC-2518R，BBI ；Surf 系列精密单道可调移液器SP10-1000，上海生工生物工程有限公司。

实验试剂

Ezup 柱式细菌基因组 DNA 抽提试剂盒SK8255，上海生工生物工程有限公司；Ezup 柱式真菌基因组 DNA 抽提试剂盒SK8259 ，上海生工生物工程有限公司；Ezup 柱式酵母基因组 DNA 抽提试剂盒SK8257 ，上海生工生物工程有限公司；DreamTaq-TM DNA Polymerase EP0702，MBI；dNTP D0056，上海生工生物工程有限公司；琼脂糖 AB0014， BBI；SanPrep柱式DNAJ胶回收试剂盒 SK8131，上海生工生物工程有限公司；DNA Ladder Mix maker SM0337，上海生工生物工程有限公司；pMD 18-T Vector连接试剂盒 D101A，Takara； SanPrep 柱式质粒DNA 小量抽提试剂盒 SK8191，上海生工生物工程有限公司；枪头、 PCR管、离心管等，上海生工生物工程有限公司

实验方法

16S rRNA的扩增及序列测定 从平板上挑取单菌落，移入NB液体培养基培养，取对数生长期新鲜菌液1ml，12000g离心3min收集菌体，双蒸水洗涤一次，60μL双蒸水悬浮细胞，100℃水浴2min，13000g高速离心1min，上清作为DNA模板，-20℃备用，参考细菌通用引物序列，上游引物F1：5’-CAGAGTTTGATCCTGGCT，下游引物R1：5’-AGGAGGTGATCCAGCCGCA,由 生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

反应体系为25ul反应体系：PCRmaster 12.5μL，上下游引物各0.5μL，DNA模板（100ng/mL）0.5μL，加双蒸水至25μL。反应条件：95℃预 变 性2min；95℃ 1min，59.4℃ 1min，72℃1min，30个循环；70℃延伸10min。

取5μLPCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，用DNA Marker 作为参照。将PCR产物送到生工生物工程（上海）股份有限公司进行序列测序。测序结果在GeneBank软件对相近序列进行同源性分析，构建系统发育树。

实验结果

测序结果测序结果在NCBI GeneBank数据库中进行Blast分析比对，发现未知菌X1的16s rRNA基因片段大小为1494 bp，未知菌X1为1491 bp。

测序结果在NCBI数据库中进行Blast比对分析，发现与未知菌X1匹配度最高的集中全序列是赖氨酸芽孢杆菌的各株系的16s rRNA序列，未知菌X2匹配度最高为环状芽孢杆菌，其匹配度均高达99%。

系统发育树根据软件MEGA构建进化树见图X，分析菌株X1与Lysinibacillus菌属的细菌具有较近的同源性。X2与Bacillus circulans具有较近的同源性。综合前述的形态学和生理生化试验鉴定结果，可判定试验分离得到的菌株为赖氨酸芽孢杆菌和环状芽孢杆菌。

讨论

在通过对食品包装用纸的微生物检测过程中，大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、葡萄球菌和溶血性链球菌都未曾检出过，可能与食品包装用纸生产的原料、加工工艺以及本身特性与食品不同。纸的原材料是木材，因此多见于动物粪便、蛋奶、肉类制品来源的大肠杆菌、志贺氏菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌无法检出。

市场上72批次食品包装用纸中微生物检测结果

而本次实验筛出的未知菌，以及大批量食品包装用纸初筛过程中高检出率的霉菌则都拥有一个特性，就是环境中存在的微生物，且都具有耐酸耐碱耐高压耐高温的芽孢。

赖氨酸芽孢杆菌和环状芽孢杆菌都属于芽孢杆菌属，革兰氏阳性杆菌，多发现于土壤、污水、木材等。赖氨酸芽孢杆菌和环状芽孢杆菌不同的在于是指细胞壁上存在赖氨酸-天冬氨酸型肽聚糖。虽然二十世纪赖氨酸芽孢杆菌被认为与热带溃疡形成和皮肤或和呼吸道感染有关【3】，但很多实验都未证明这一结论【3、4】，仍不排除其安全风险。

环状芽孢杆菌一种革兰氏阳性菌，也是是一种条件致病菌[5]。从微生物安全等级分类，它属于4类安全微生物，但是它可以引起免疫功能受损患者患败血症，并导致患者死亡[5]，或是引起伤口感染[6]。这种细菌也能引起菌血症、脓肿，并能引起人类脑膜炎[5]。

环状芽孢杆菌是一种兼性厌氧菌。有氧存在，可以通过有氧呼吸产生ATP（三磷酸腺苷），无氧状态下可以切换到无氧呼吸。实验证明环状芽孢杆菌在4℃、30℃、36℃、42℃均可生长，最佳生长温度范围应为30℃～36℃。在pH6-9的酸碱度范围内均可生长，最佳生长pH应为7. 这种细菌能在营养匮乏产生内孢子，孢子使细菌长时间处于休眠状态，营养状态良好时会重新激活，进入营养阶段。实验证明，内孢子在高温高压高酸碱度情况下均可存活。

本次食品用包装用纸微生物风险筛查中，筛出的环状芽孢杆菌是国家标准监控范围外的具有致病风险的条件致病菌，也是国内首次发现，希望在日后食品包装用纸风险检测工作中提供理论和数据支持。